电针对功能性消化不良肝郁脾虚大鼠十二指肠黏膜机械屏障及其调节蛋白的影响❋

王 丹，张红星△，荣培晶，侯理伟，李少源，王 瑜，王俊英，张金铃，赵 斌，国 笑，张 悦，张紫璇，王艺霏，何家恺，韩永丽

(1.湖北中医药大学，武汉 430061；2.中国中医科学院，北京 100700)

功能性消化不良(functional dyspepsia，FD)属于中医学功能性胃肠病范畴，主要表现为上腹痛或灼烧、餐后早饱、腹胀等，且并无引起这些症状的其他疾病，消化系统也无任何器质性病变[1-2]。现阶段主要认为，FD的发病可能与脑肠互动异常、幽门螺杆菌感染、胃肠动力障碍、内脏高敏感性、肠道菌群失调、心理及精神因素、谷物过敏(小麦不耐受)以及肠黏膜屏障受损等因素有关[3-4]。众所周知，肠黏膜屏障是防止肠内毒素等有害物质进入人体的重要防护屏障。若肠黏膜屏障受损，则肠腔内抗原、菌群、内毒素等有害因子进入肠深层甚至循环全身，导致各种疾病发生。肠黏膜屏障分为机械屏障、化学屏障、免疫屏障及生物屏障。机械屏障主要由肠上皮细胞和顶端连接复合体(apical junctional complex，AJC)构成。紧密连接(tight junction，TJ)属于AJC，可调控细胞旁通道，调节肠黏膜通透性，防止抗原物质进入肠黏膜。闭合蛋白(Occludin)和闭锁小带蛋白(ZO-1)均是重要的肠上皮TJP，其二者形成稳定的连接，对肠黏膜屏障的完整性有非常重要的意义[5]。有研究发现[4,6]，FD患者存在十二指肠屏障功能受损。本课题组前期研究发现，电针干预可提高FD肝郁脾虚大鼠小肠推进率，提示电针能改善FD相关症状[7]。因此，本研究从十二指肠机械屏障角度探究电针治疗FD新靶点及FD的发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用SPF级雄性SD大鼠30只，约6～7周龄，体质量(200±20)g，由三峡大学实验动物中心提供,合格证号SCXK(鄂)2017-0012。经湖北中医药大学实验动物福利委员会许可，饲养于湖北中医药大学SPF动物房，12 h/12 h明暗交替，室温22 ℃～25 ℃，相对湿度50%～70%,每笼5只，适应性喂养1周后开始试验,喂养期间自由饮水、摄食。

1.2 主要试剂与仪器

ZO-1抗体(武汉三鹰生物技术有限公司，批号21773-1-AP)；Occludin抗体(英国Abcam生物技术有限公司，批号Ab216327)；HRP标记羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司，BA1054)；水合氯醛(上海国药集团公司，批号40935760)；二甲苯(上海国药集团公司，批号10023418)；苏木素(美国Sigma公司，批号H9627)。

华佗牌0.35×25 mm(1寸)无菌针灸针(苏州医疗用品厂有限公司)；韩式穴位神经刺激仪(南京济生医疗科技有限公司，HANS-200 A);病理切片机(德国Leica公司，RM 2016轮转式切片机)；显微镜(日本奥林巴斯公司，BX53型生物显微镜)；HITACHI电镜(日本日立高新技术公司，HT7700-SS/FEI Tecnai G20 TWIN)；自制大鼠鼠衣及悬挂大鼠装置。

1.3 动物分组及造模

将30只SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组、模型组、电针组各10只。模型组及电针组大鼠参考多因素干预法[8]并加以适当改良，制备FD肝郁脾虚模型。

①冰生理盐水灌胃：配制0.9% NaCL溶液，置于冰箱中冰冻至-4 ℃，灌胃每次2 mL，每日1次；②夹尾法刺激：用长尾夹包裹纱布以免损伤大鼠尾部，夹在大鼠尾部后2/3处,以不破皮为度,令其暴怒并激怒全笼大鼠，表现为大鼠均站立，双上肢打斗，每天1次(刺激间隔不少于6 h)，每次30 min；③隔日禁食，饮水正常。以上三法按顺序同时实施，造模20 d。每日21时称大鼠体质量并登记，且所有大鼠每日食物等重量。

造模成功标志：大鼠体质量进行性减轻；活跃程度从时常笼中自发打斗至喜成堆蜷缩，敲打笼子仍不动弹，抓捕反应迟钝；情绪由稍有声响就易怒烦躁转变为持续噪音刺激或是喂食仍无特别反应，情绪异常低落；鼠毛从白净顺滑至凌乱、倒张、发黄；大鼠粪便从深棕色、干燥、质硬、无臭、长条圆柱状进展成棕黄色、湿润、质软、微臭、短条圆柱状，最后成为黄绿色稀便，可见未消化的颗粒饲料且奇臭。经模型评价，模型组及电针组20只大鼠造模均成功，在造模期间空白组大鼠给予安静环境隔离，不予任何处置。

1.4 电针刺激

造模结束后第2天开始对电针组进行电针干预。给电针组大鼠穿上定制鼠衣后悬挂于自制悬挂架上。参照《实验针灸学》[9]取大鼠“后三里”穴及“太冲”穴，酒精局部消毒后，采用0.35×25 mm(1寸)毫针分别直刺深度约12.5 mm(约0.5寸)、5 mm(约0.2寸)。将双侧“后三里”穴接韩氏穴位神经刺激仪，连续波，频率2 Hz，强度1 mA，双侧“太冲”穴静留针。每次治疗时间30 min，每日治疗1次(9AM～11AM)，治疗14 d。空白组和模型组在治疗期间给予电针组同样的穿鼠衣及悬吊，不予其他任何处置，在安静环境隔离。在电针组最后1次治疗结束，将各组大鼠称重并禁食24 h后取材。

1.5 免疫印迹法检测十二指肠ZO-1、Occludin蛋白表达

取少量十二指肠粉碎组织加入0.3 mL裂解液匀浆后裂解，随后于4 ℃下12000rpm离心5 min，取上清液。提取总蛋白之后用DG-3022 A酶标仪测定蛋白浓度，随后将提取的蛋白上清与5ⅹ蛋白上样缓冲液进行沸水浴中10 min，使蛋白变性。配置5%浓缩胶、12%分离胶后开始电泳、转模、免疫印迹显色等步骤检测后得到灰度条带，采用Image J软件对蛋白条带灰度值进行测定。

1.6 透射电镜观察十二指肠机械屏障

取1 cm2十二指肠组织块迅速置于2.5%的戊二醛固定液中，并于4 ℃固定4 h，随后移除固定液，用PBS漂洗3次，每次15 min。用1%的锇酸和PBS室温(20 ℃)固定2 h后再次用PBS漂洗3次，每次15 min。按乙醇梯度(50%-70%-80%-90%-95%-100%)上行脱水，每次15 min。采用丙酮渗透过夜后60 ℃聚合48 h，随后切成60 nm超薄片。铀铅双染色(2%醋酸铀饱和水溶液，枸橼酸铅，各染色15 min)切片，室温干燥过夜后用日本HITACHI公司电镜观察。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠十二指肠ZO-1、Occludin表达比较

图1示，与空白对照组比较，模型组大鼠十二指肠ZO-1、Occludin表达显著减少(P<0.05)。与模型组比较，电针组大鼠十二指肠ZO-1、Occludin表达明显增高(P<0.05)。

注：与空白组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05图1 各组大鼠十二指肠ZO-1、Occludin表达情况

2.2 透射电镜下观察

正常组大鼠十二指肠上皮细胞排列整齐，细胞膜完整，细胞间隙正常(见图2A)。模型组电镜下见十二指肠上皮细胞间隙增宽，紧密连接模糊，绒毛排列杂乱，线粒体肿胀(见图2B)。电针组电镜下见十二指肠上皮细胞间隙较清晰，未见增宽且绒毛排列整齐(见图2C)。

注：紧密连接：黑色箭头；BL:bowel lumen，十二指肠肠腔侧图2 各组大鼠十二指肠黏膜超微结构比较

3 讨论

FD严重影响患者的生活质量，增加了社会医疗负担[10]。在发达国家，约有12%～15%的FD患者，且有逐年升高的趋势[12]。目前FD的治疗方式主要是西药(促动力剂、抑酸剂、抗幽门螺杆菌剂等)，因西药疗效欠佳，无法适应复杂的个体差异，中医疗法逐渐被人们认可[12]。中医疗法中，电针治疗FD疗效满意[13-18]。本研究采用夹尾刺激等复合因素造模，使得大鼠暴怒，怒伤肝，肝木克伤脾土，损脾气，久则阳邪转为阴邪，形成肝郁脾虚证，模型评价可证实。足三里穴为胃经合穴，可健脾益气；太冲穴为足厥阴肝经原穴，可疏肝理气、和胃降逆。本证涉及肝脾，此两穴合用共奏健脾疏肝之效。

紧密连接蛋白(tight junction,TJ)是参与调节黏膜机械屏障的重要成分之一，其通过调控内皮及上皮细胞旁通透性发挥作用[19]。紧密连接蛋白由维持细胞间屏障的跨膜蛋白及调控紧密连接蛋白定位的细胞质支架蛋白组成[20]，ZO-1、Occludin为跨膜蛋白。Occludin可调节黏膜屏障及细胞间通透性，是第一个被确认的紧密连接跨膜蛋白。ZO-1表达在细胞之间，其定位对维持TJ的功能至关重要。ZO-1还可发挥胞内支架蛋白的作用，将Occludin固定于细胞骨架从而调节紧密蛋白完整性[21]。有研究表明[6]，黏膜通透性增加的主要原因是紧密连接蛋白表达降低，因此ZO-1和Occludin是参与调节黏膜机械屏障的重要蛋白。

本研究结果表明，模型组大鼠ZO-1、Occludin蛋白表达水平显著降低，且细胞紧密连接增宽、模糊，绒毛排列杂乱，提示FD的发病机制与十二指肠黏膜机械屏障有关。经治疗后，电针组大鼠ZO-1、Occludin蛋白表达水平较模型组升高，且细胞连接及绒毛接近正常，提示电针可能通过调节ZO-1、Occludin蛋白表达水平，恢复十二指肠黏膜机械屏障来治疗FD。黏膜屏障包括化学屏障、机械屏障及免疫屏障。本研究仅就紧密连接蛋白及细胞间紧密连接超微结构，反映了机械屏障方面，拟进一步从化学屏障及免疫屏障角度全面深入探究肠黏膜屏障与FD发病机制关系和电针治疗FD的作用机制。