嗜水气单胞菌穿梭质粒载体p BKPU01的构建、表达和鉴定

张 莉，张小蒙

（江苏医药职业学院药学院，江苏盐城 224005）

0 引言

嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体，是多种水生动物的原发性致病菌［1］，为条件致病菌，是典型的人-兽-鱼共患病病原菌［2］，嗜水气单胞菌的变异菌株较多，多数菌株对氟哌酸、菌必治敏感，嗜水气单胞菌表现多种抗性［3］，其中一个主要原因是含有多种质粒［4］。本实验室从嗜水气单胞菌中分离得到一种质粒，命名为质粒pBK760，该质粒具有多种位点和抗性，具有良好的载体特征。

pMD20是一种高效克隆PCR产物的专用载体［5］。该载体以pUC19载体为基础，在其多克隆位点处的Xba I和BamH I位点之间增加了Spe I，Nde I，EcoRV3种酶切位点，经EcoR V酶切后再在两侧的3’端添加“T”制备而成［6］。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’端添加一个“A”的特性，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率［7］。

虽然质粒pBK760和pMD20均可单独作为载体来使用，但是如果可以将其优点相结合，就可以发挥它们各自的优势，本实验就结合质粒pBK760和pMD20两方面的优点，利用现代技术构建了一种全新的穿梭质粒载体（pBKPU01），便于开展相关基因功能研究和遗传育种工作。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 质粒和载体

质粒pBK760由本实验室从嗜水气单胞菌中分离并保存，pMD20购自大连宝生物。

1.1.2 主要试剂

限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker均购自大连宝生物；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自上海生工；其他常规试剂为进口或国产分析纯。

1.2 引物设计与合成

根据质粒pBK760序列，采用Oligo 6.0软件设计1对特异性引物P1、P2，上游引物P1序列为：ATCGTCGACCCTCTAGATGCAG，下游引物P2序列为：CTGACTCTAGCAGGTCGAGGAT。引物由上海生工合成。

1.3 质粒pBK760的提取

挑取嗜水气单胞菌单菌落，接种于5mL含50ug/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12 h。菌液用质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒pBK760，-20℃储存待用。

1.4 质粒pBK760线性化

以质粒pBK760为模板，通过设定引物（P1和P2）进行PCR，使环状质粒pBK760线性化，PCR的具体反应条件如表1所示。

反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 4.5 min，32循环；72℃延伸10 min；4℃保存。PCR扩增后的产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，将检验正确的片段纯化回收。

1.5 质粒pBK760和载体pMD20的连接

将线性化质粒pBK760和载体pMD20进行连接，反应体系如表2所示。

操作步骤如下：16℃连接过夜，取2.5μL连接产物转化50μL E.coli DH5α感受态细胞，取100μL菌液涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行蓝白斑筛选。挑取阳性转化子，转入5 mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养12 h，用质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒，获得穿梭质粒载体pBKPU01。

表1 质粒p BK760线性化PCR反应具体条件

表2 质粒p BK760和载体p MD20连接体系

1.6 转化、酶切验证和分析

制备嗜水气单胞菌感受态细胞，用电转化方法转化感受态细胞［8］，用质粒DNA小量抽提试剂盒提取质粒，通过HindⅢ和EcoRⅠ进行双酶切验证。结果证明的确是质粒pBKPU01，说明构建的穿梭载体pBKPU01能够在嗜水气单胞菌中复制表达。确定重组质粒后进行测序分析（华大基因），序列分析结果和质粒pBK760序列相同，验证正确。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

以P1、P2为引物，以质粒pBK760为模板进行PCR扩增，凝胶电泳结果如图1所示，成功扩增出长度为3 817 bp的质粒pBK760，与预期结果一致，可进行下一步实验。

2.2 pBKPU01单、双酶切鉴定

对转化并提取的质粒pBKPU01通过HindⅢ和EcoRⅠ进行单、双酶切验证，酶切后均得到6 000 bp左右的片段，其他片段过小未能显示，与预期结果一致，凝胶电泳结果如图2所示。

2.3 pBKPU01图谱构建

以DNAMAN为工具［9］，构建pBKPU01图谱，图谱如图3所示。该穿梭质粒载体包括位于3 355～3 561的启动子位点、位于3 726～3 812的信号肽编码基因、位于1 592～2 363的卡那霉素抗性基因、位于2531～2735的博来霉素抗性基因，位于347～676的lacZ基因以及位于1 833～2 693的氨苄青霉素抗性基因。

3 讨论

图1 质粒p BK760经PCR线性化后的凝胶电泳

图2 转化E.coli DH5α后提取的穿梭质粒载体p BKPU01单、双酶切鉴定电泳

图3 穿梭质粒载体p BKPU01图谱

嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体，是多种水生动物的原发性致病菌，为条件致病菌，是典型的人-兽-鱼共患病病原菌，嗜水气单胞菌的变异菌株较多，多数菌株对氟哌酸、菌必治敏感，嗜水气单胞菌表现多种抗性，其中一个主要原因是含有多种质粒，本实验室从嗜水气单胞菌中分离得到一种质粒，命名为质粒pBK760，该质粒具有多种位点和抗性，具有良好的载体特征。

pMD20是一种高效克隆PCR产物的专用载体。该载体以pUC19载体为基础，在其多克隆位点处的Xba I和 BamH I位点之间增加了 Spe I，Nde I，EcoR V3种酶切位点，经EcoR V酶切后再在两侧的3’端添加“T”制备而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’端添加一个“A”的特性，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率［10-13］。

虽然质粒pBK760和pMD20均可单独作为载体来使用，但是如果可以将其优点相结合，就可以发挥它们各自的优势，本研究就结合质粒pBK760和pMD20两方面的优点，利用现代技术构建了一种全新的穿梭质粒载体（pBKPU01），便于开展相关基因功能研究和遗传育种工作。