激光捕获显微切割在肿瘤多组学研究中的应用进展

常文婧， 赵彦艳

中国医科大学附属盛京医院临床遗传科，沈阳 110004

生物组织是由不同结构和功能的细胞群组成的三维立体结构，而组织的生物学性状是由数量占大多数的细胞群决定的，这样会忽视或掩盖数量较少的细胞群的关键变化。实体肿瘤组织由实质和间质2个部分构成，肿瘤实质即为肿瘤细胞，是肿瘤的主要成分，具有组织来源特异性；肿瘤的间质起到支持和营养肿瘤实质的作用，构成肿瘤细胞生长的微环境。此外，手术切除的肿瘤组织还包括与肿瘤细胞具有同种组织来源、且表型相对正常的癌旁组织。为了明确肿瘤发病机制，发掘敏感且特异的肿瘤标记物，有必要对离体肿瘤组织内的实质、间质和癌旁组织进行明确分类，因此，如何从成分复杂的组织中获得单一的细胞群成为肿瘤研究亟待解决的问题[1]。

激光捕获显微切割(laser capture microdissection，LCM)技术是于20世纪90年代末由美国国立研究院开发，并由美国Arcturus公司商品化而发展起来的一门新技术。LCM技术可以在显微镜直视下从器官或组织中准确获取某种特定的细胞群或单个细胞，其出现使解决肿瘤异质性这一难题成为可能。随着多组学测序技术的发展，LCM技术作为同质化样本的重要获取手段已成为肿瘤基础研究中的支撑技术，在单细胞测序方面具有不可替代的地位。基于此，本文主要对LCM的原理、优势及其在肿瘤多组学研究中的应用进行综述，并对其未来可能的发展方向进行展望，以期为肿瘤的研究和治疗提供新的思路。

1 LCM系统原理及优势

激光捕获显微切割，即在显微镜直视下利用激光获取靶细胞。LCM技术可以精确地捕获实验所需的细胞或组织，是一种从异质组织标本中分离特定细胞群的最先进的技术。显微切割的发展经历了手动显微切割、机械控制显微切割、液压控制显微切割以及激光捕获显微切割。为了高效、精确地获得纯净的靶细胞，1996年，美国国立卫生研究院发明了LCM技术；1997年，美国Arcturus公司成功研发了LCM系统，并且实现了其商品化销售；随后，德国Zeiss公司、Leica公司的LCM产品也迅速发展，并在国际上推广应用；近年来，瑞士MMI公司也推出其CellCut LCM系统，并在市场占据一席之地[2-5]。目前，主流的激光捕获显微切割系统有四大品牌，即ABI ArcturusXT、MMI CellCut Plus、Zeiss PALM MicroBeam、Leica LMD6500和LMD7000，其主要区别见表1。

表1 常用LCM系统特点对比[2-5]Table 1 Comparison of characteristics of common LCM systems[2-5]

根据激光类型可将LCM分为2大类：红外LCM(infrared LCM，IR LCM)和紫外LCM(ultraviolet LCM，UV LCM)[6]。各类LCM系统的组成大致包括显微镜(正置或倒置)、固态激光二极管、激光控制器、可固定玻片的载物台和照相机等。LCM系统通常可连接到个人计算机，由操作者在镜下选取目标区域，手动控制激光发射[7-9]。以Leica LMD7000为例，实验者使用表面附有薄膜——聚萘二甲酸乙二醇酯(polyethylene naphthalate，PEN)膜的载玻片，将样品制备成切片或涂片，在显微镜下选取实验所需的细胞群，发射紫外激光使PEN膜边缘融化，随后目标细胞在重力作用下掉落在事先安装好的EP管的盖中，完成收集。激光发射所产生的大部分能量被PEN膜吸收，组织达到的最高温度约为90 ℃，且仅维持几毫秒，避免了对其他生物大分子的损伤[8,10]。

以富集循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)为例，常用的方法包括密度梯度离心法、免疫磁珠法[11]、流式细胞术[12]以及微流体芯片[13]等。上述传统方法主要依赖于细胞表面的免疫结合作用或者细胞本身的物理特性，易受到细胞群的种类、数量以及抗体的特异性等多种因素的影响。对于数量稀少的细胞群，传统方法难以避免非目标细胞的污染。细胞培养虽然可以解决细胞异质性的问题，但是培养条件使细胞脱离了生物体内环境，不能完全反映在体状态。与以上方法相比，LCM技术具有明显的优势。①样品来源广泛。将样本制成切片并进行组化染色后即可利用LCM技术获取目标细胞，部分LCM系统还能够切割活细胞用于培养[14-15]。②捕获效率高，操作简单。在显微镜直视下选取靶细胞，使用鼠标在显示屏上选择要切割的范围，并且可以看到切割轨迹，收集结果可靠。③能够以高能量激光切割薄膜，避免接触样品带来外界污染。激光发射所产生的能量可以瞬间融化薄膜并分离目标细胞及其周围组织，从而保证组织结构的完整性，避免了传统显微操作时周围组织碎屑的污染；同时，激光产生的热量会被瞬时冷却，不会破坏靶细胞内的核酸与蛋白质，这对于下游蛋白质组学和转录组学的分析极为重要。

近年来，随着微量RNA提取、单细胞全基因组扩增(whole genome amplification，WGA)[15]等分子生物学技术的发展，LCM结合二代测序(next-generation sequencing，NGS)、双向凝胶电泳(dimensional gel electrophoresis，2-DE)、液相色谱-串联质谱(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)、实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)等技术在肿瘤蛋白质组学、基因组学以及转录组学等领域展现出了巨大的潜力。

2 基于LCM的肿瘤蛋白质组学研究

LCM能够精确、便捷地实现组织的选择和分离，同时保证样品的纯度，多应用于蛋白质组学分析中的样品制备环节。已有研究利用LCM技术对混合组织进行分类获取，联合LC-MS/MS或qRT-PCR技术对样本进行蛋白质组学分析，验证了组织异质性问题[16-17]。肿瘤蛋白质组学与LCM技术相结合可以鉴定良、恶性肿瘤中差异表达的蛋白质，筛选特异性的肿瘤分子标记物，进而明确致病机制或以此作为新的治疗靶点[18]。

LC-MS/MS是蛋白质组学最基本的分析手段，在肿瘤蛋白质组学分析中同样被广泛应用。传统的2-DE分离对蛋白质的检验量有限，而同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)技术具有高通量、样本类型无限制等优点，在肿瘤蛋白质组学研究中的应用逐渐增多[19-21]。如Li等[20]使用LCM技术获取肺腺癌组织和正常组织，再采用iTRAQ技术与2D-LC-MS/MS相结合的方式检测出510个差异蛋白，其中35.5%为与线粒体相关蛋白。C1QBP为补体成分1q亚单位结合蛋白，定位于线粒体，是氧化磷酸化的关键分子，参与肿瘤代谢的调节。该研究发现在肺癌组织中C1QBP表达明显升高，且C1QBP的上调与淋巴结转移、TNM病理分级及临床分期有关。此外，通量更高的非标记LC-MS/MS的使用也在不断增加。Zhang等[22]分别利用LCM技术和酶解法(enzymatically isolated and cultured，EIC)从3例新鲜胰腺冰冻切片中获取等量的胰岛细胞和腺泡组织，结合非标记LC-MS/MS，将LCM和EIC获得的胰腺组织进行蛋白质表达谱比对，筛选出了百余种共同表达的蛋白质以及几十种具有不同功能的差异表达蛋白。对于胰腺等酶含量丰富的组织来说，LCM避免了EIC过程中的降解或污染，能够如实反映组织或细胞的在体状态。

LCM可以从极少量的样本中将异质性细胞进行分类富集，适用于临床样品稀少的情况，但这也对下游蛋白质谱检测的灵敏度和分辨率提出了较高的要求。Palmer-Toy等[23]报道了一种基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)，该方法可直接分析经LCM切割的样本，且分辨率高、预处理时间短、所需样本量少(约1 250个细胞)。Xu等[17]开发了一种集成化蛋白质组学样品前处理技术(simple and integrated spintip-based proteomics technology，SISPROT)，并对LCM技术进行了优化，将二者相结合，以面积为5 mm2、厚度为10 μm的结肠肿瘤病理切片为起始材料，建立了第1个包含肿瘤细胞、肠上皮细胞、淋巴细胞和平滑肌细胞4种重要结肠肿瘤细胞类型的蛋白质组数据库。

3 基于LCM的肿瘤基因组学研究

基因组学研究同样印证了广泛存在的组织异质性问题，如在泛发性萎缩性良性大疱性表皮松解症患者中，由于突变的COL17A1基因发生二次改变，ⅩⅦ型胶原蛋白的部分再表达，表现出了嵌合性状[24]。杂合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)也是肿瘤组织异质性的体现，LOH常用于研究肿瘤抑癌基因，定位染色体上的突变“热点”，发现肿瘤早期的遗传改变及其发生顺序[25-26]。对于LOH的研究，首先要保证样本的纯度，LCM的应用有效避免了非目标细胞的混杂，使用微量样品即可检测，提高了LOH检测的灵敏性和检出率。Dias等[27]利用LCM技术分别从乳腺浸润性导管癌、原位导管癌、正常乳腺小叶及淋巴结中分离出上皮细胞，对9号染色体短臂的5个微卫星位点进行LOH检测，发现在浸润性导管癌中LOH频率最高，而且来源于同种组织的细胞存在LOH异质性。除LOH分析外，还可利用LCM进行其他基因组学分析，如LCM结合微阵列分析可被用于肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)基因组畸变的鉴定[28]。近年来，甲基化研究也逐渐成为肿瘤学热点[29-30]，Pisanic等[29]利用LCM技术获取高度恶性浆液性卵巢癌(high-grade serous ovarian carcinoma，HGSOC)组织及正常卵巢组织，结合定量甲基化特异性实时PCR(quantitative methylation-specific real-time PCR，qMSP)对HGSOC全基因组甲基化水平进行分析，确定了一组高特异性的甲基化生物标志物(c17orf64、IRX2、c6orf174、OTX2、LOC200726和NEUROD1)以用于肿瘤的早期筛查。

随着单细胞测序技术的发展，LCM逐渐成为单细胞研究的有力工具。2014年，Pascarella等[31]将LCM技术与纳米基因表达帽分析(cap analysis of gene expression，CAGE)技术、NGS技术相结合，首次发现了在小鼠主嗅上皮(main olfactory epithelium，MOE)中，1型及2型梨鼻受体(vomeronasal type-1 receptors，V1Rs)、(vomeronasal type-2 receptors，V2Rs)存在转录活性，揭示了小鼠嗅觉功能单元间存在受体表达的交互作用。而Park等[32]利用LCM技术精确分离前列腺癌患者的单个CTC，结合单细胞测序发现2例CTC单细胞的ATR、KMT2C、FANCC基因发生错义突变，该发现揭示了肿瘤转移的发生机制，对于研究肿瘤转移中的关键CTC亚群具有重要意义。现阶段，LCM还被用于无创产前筛查(non-invasive prenatal testing，NIPT)平台的研发。NIPT主要有2种策略，一种是基于孕妇外周血中的胎儿游离DNA，另一种是基于胎儿有核红细胞。后者所获得的胎儿基因组信息相对完整，但因孕妇外周血中胎儿有核红细胞过于稀有，难以获得纯净样本，因此基于胎儿有核红细胞实现NIPT仍是一个国际难题。杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是由于抗肌萎缩蛋白基因(dystrophin，DMD)突变导致的全身肌肉呈渐进性损伤和运动功能减退的X连锁隐性遗传病，DMD基因突变类型有多种，大片段缺失占60%～65%，大片段重复占5%～10%，点突变、小片段缺失和重复占25%～30%。本课题组最近通过制作孕妇外周血涂片，利用LCM技术精准捕获了血涂片中极稀有的胎儿有核红细胞，经单细胞全基因组扩增后，采用Sanger法对DMD基因完成了NIPT[33]。LCM作为一种最先进的单细胞获取工具，有望成为基于胎儿有核红细胞的NIPT的支柱型技术。

4 基于LCM的肿瘤转录组学研究

LCM可以将肿瘤细胞与正常细胞进行快速分离而不会出现明显的RNA降解，再结合下游RNA检测方法以构建肿瘤的全转录组及差异转录组信息。多个研究团队试图从不同类型的LCM组织中摸索RNA回收的最佳条件[5,34-38]。目前已有多种RNA测序方法用于肿瘤全转录组分析，如qRT-PCR[39-41]、NGS[3,37-38,42]以及微阵列分析[35,43]，其中NGS在肿瘤转录组学分析中应用最为广泛。

Civita等[37]使用LCM技术从胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)福尔马林固定石蜡包埋(formalin fixed paraffin-embedded，FFPE)样本的不同组织分区中分离星形胶质细胞、神经元和血管内皮细胞，经NGS和数据分析筛选出8 585个差异表达基因，进一步分析发现大部分差异表达基因与信号转导、跨膜转运、调节细胞生长等功能密切相关；GBM的异质性还体现在其不同细胞群具有独特的肿瘤微环境，如在坏死区的星形胶质细胞中，促进血管生成和参与细胞迁移的基因过表达，这与此前报道的GBM可以促进细胞浸润生长、迁移、血管生成一致[37]。

此外，微阵列分析也是转录组学分析的常用手段。Roy等[35]利用LCM技术从完整皮肤和伤口边缘活检收集血管组织，利用微阵列分析建立两者基因表达图谱。在18 400个候选基因中，伤口部位血管中检出了53个上调基因和24个下调基因，其中，新的肿瘤血管生成促进因子——骨膜素(periostin，POSTN)在伤口边缘血管中的表达是正常皮肤的96倍。该方法可以作为转录组学研究的有力工具，对于多种生物学过程的分子机制研究具有重要意义。

对于LCM样本的测序方法也在不断改进，从而使其在处理本身条件不佳的样品时仍能有较高的可信度。最新报道称Smart-3SEQ能够保持较好的单细胞测序灵敏性和准确性，通过单独分离和测量每个细胞的转录组信息，将组织学和分子病理学的差异细化至细胞水平[42]。转录组学结合LCM技术能够精准地反映细胞的“原位”信息，对于肿瘤生物学、病理学和生物标志物鉴定等方面的研究具有重大作用。

5 展望

LCM技术与传统的机械法和酶解法等样品获取方式相比具有强大的技术优势，在肿瘤的蛋白质组学、基因组学以及转录组学研究领域展现出巨大潜力，在探索肿瘤发生发展机制和筛查肿瘤标志物的科学研究中得到极大地应用。然而，针对LCM的特点，其仍有以下3个方面需要完善。①切片的制备方法对于LCM样本质量的影响较大，尤其是经过固定的石蜡切片，可能对下游蛋白的分析造成较大影响[44]。因此，针对不同来源的组织，优化处理条件、建立标准化处理方式十分必要。如利用傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR)成像技术对未经组化染色的弥漫性恶性间皮瘤切片进行识别和分型，精确度达到85%，避免了化学染色对组织的损伤以及观察者的主观效应[45]。②LCM作为一种高精确度的样本分离工具，能够精确地从特定区域捕获目标细胞，其数量可以低至几百个细胞甚至是单个细胞。而对于极微量细胞的处理和分析，则依赖下游高灵敏度和准确度的处理方法。因此，提高微量样本分析的准确性和可重复性才能使LCM技术真正用于临床肿瘤学。目前LCM作为一种极其重要的单细胞样本获取工具，已经在CTCs测序中发挥了重要作用，随着现有单细胞分析技术的兴盛和新技术的兴起，如单细胞全基因组扩增[46]、单细胞测序[47-50]，研究人员对肿瘤的认识将更加丰富与全面。③对LCM系统来说，盖玻片会阻碍激光的作用，裸露的组织切片在显微镜下识别时，样品折光率的改变可能会导致视野模糊，达不到理想的分辨率。对于稀有细胞的捕获，如对肿瘤转移具有重要作用的CTCs，镜下人工寻找效率极低。当前，自动识别是人工智能的重要研究方向，若将相应的识别软件搭载到LCM系统中，实现全自动取样，对于肿瘤的诊断和治疗具有指导意义。