乌骨鸡蛋清与普通鸡蛋清酶解物抗氧化活性

沈 刚，洪 标，江豪杰，刘 偲，于 慨，田颖刚*

(南昌大学a.食品科学与技术国家重点实验室；b.教育部生物质转化中心，江西 南昌 330047)

鸡蛋蛋清是日常生活中优质蛋白质来源,氨基酸组成适合人体的需要[1]。鸡蛋蛋清主要包含卵清蛋白、卵转铁蛋白、溶菌酶、卵粘蛋白、卵球蛋白等[2]。乌骨鸡作为我国特有的药食两用的滋补品应用历史悠久，具有补肝肾、益气血，尤其在增强体力、补血、治疗糖尿病等方面效果显著[3]。乌骨鸡蛋中富含谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、天门冬氨酸等鲜味氨基酸，蛋清、蛋黄、全蛋中鲜味氨基酸比普通鸡蛋分别高20%、55%、35%[4]，乌骨鸡蛋营养价值有别于普通鸡蛋，乌骨鸡蛋的开发利用拥有广阔的应用前景。

研究发现蛋清蛋白酶水解物及蛋清肽具有抗菌[5-6]、降血压、抗癌等[7]生物活性，如在鸡蛋清蛋白中分离得到的转铁蛋白具有高血管紧张素酶抑制剂活性[8]；从蛋清蛋白水解物中分离出抗氧化肽，并通过串联质谱和红外光谱鉴定新型的抗氧化肽[9]；以鸡蛋清蛋白为原料，经酶解得到新型血管紧张素转换酶(ACE)抑制肽，经过试验证明该蛋清肽具有ACE抑制活性、抗氧化活性和抗凝血活性等生物活性[10]；鸭蛋蛋清蛋白经木瓜蛋白酶酶解得到的酶解物具有很强的ACE抑制作用和抗氧化活性[11]；研究表明[11-13]酶解法所得蛋清肽还具有很强的DPPH自由基清除能力和羟自由基清除能力。

普通禽蛋的蛋清及其酶解物的研究较多，但乌骨鸡蛋清酶解产物的研究鲜有人涉及，特别是比较相同酶消化条件下乌骨鸡蛋清和普通蛋清酶解消化产物在抗氧化活性方面的差异性尚未见文献报道。本文采用相同的酶解消化条件分别对乌骨鸡蛋清和普通鸡蛋清进行酶解，在优化后抗氧化活性实验条件下，比较了两种蛋清酶解物上清组分抗氧化活性的差异性，为乌骨鸡蛋的进一步开发利用提供科学依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜乌骨鸡蛋20枚 泰和县汉君雄实业发展有限公司提供；新鲜普通鸡蛋20枚 京白蛋鸡鸡蛋(购于江西南昌旺中旺超市)；复合蛋白水解酶(100 U·mg-1)(广西庞博生物工程有限公司)；抗坏血酸，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，邻苯三酚，三氯乙酸，硫酸，硫酸亚铁，水杨酸，30%过氧化氢溶液，氯化钾，氯化钙，无水乙酸钠，冰醋酸均为国产分析纯。

759S紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)；RE-52型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；KQ-3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SHZ-Ⅲ型循环水真空泵(上海亚荣生化仪器厂)；XB-220A型分析天平(瑞士普赛利斯公司)；DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精密实验设备有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 乌骨鸡蛋清和普通蛋清酶解产物的制备

分别取乌骨鸡蛋清和普通蛋清各50 g，加入去离子水搅拌均匀置于酶解罐中，使蛋清浓度达到5%，当物料的温度达到50 ℃，加入蛋清质量0.4%的复合蛋白水解酶，酶解时间为5 h，酶解完成后迅速升温灭酶，灭酶温度为80 ℃，灭酶时间10 min；冷却至室温后，4 000 r·min-1离心15 min取上清液，再经0.45 μm微孔滤膜过滤，真空浓缩、冷冻干燥，放入干燥器备用。

1.2.2 DPPH自由基的清除能力实验

参考文献[14]方法，实验设样品组、对照组和空白组。样品组各样品均用40%乙醇溶液配制，分别配制浓度为2.5，5，10，20，30，40，50 μg·mL-1的抗坏血酸溶液和0.125，0.25，0.5，1，2，4 mg·mL-1的乌骨鸡蛋清酶解物及普通鸡蛋清酶解物溶液。反应总体积为3 mL，样品组在比色管中依次加入的0.1 mmol·L-1DPPH-40%乙醇溶液2 mL，样品溶液1 mL；对照组依次加入40%乙醇溶液2 mL，样品溶液1 mL；空白组依次加入0.1 mmol·L-1DPPH-40%乙醇溶液2 mL，40%乙醇溶液1 mL。各组试样避光反应50 min后，517 nm处测定吸光值。按下式分别计算各样品浓度下的DPPH自由基清除率：

式中：Ai为样品组吸光值；Aj为对照组吸光值；A0表示空白组吸光值。分别以样品浓度为横坐标，DPPH自由基清除率为纵坐标，建立样品浓度与DPPH自由基清除率的量效关系图，计算出DPPH半数清除浓度(IC50)。

1.2.3 羟自由基的清除实验

以参考文献[15]方法为基础，分别考察亚铁离子浓度、H2O2溶液浓度对羟自由基生成量影响以及水杨酸浓度对显色效果的影响，优选出最适的反应条件。

亚铁离子浓度对羟自由基生成量的影响 分别吸取体积为(0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1，1.2 mL)3 mmol·L-1的FeSO4溶液于10 mL比色管中，依次加入去离子水1 mL，6 mmol·L-1的H2O2溶液1 mL，6 mmol·L-1水杨酸溶液1 mL，充分混匀，37 ℃水浴40 min，用去离子水补足至5 mL，525 nm下测定吸光值。Fe2+终浓度分别为(0，0.06，0.12，0.24，0.36，0.48，0.6，0.72 mmol·L-1)。绘制Fe2+终浓度与吸光值的关系曲线。

H2O2浓度对羟自由基生成量的影响 分别吸取体积为(0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1，1.2 mL)的6 mmol·L-1H2O2溶液于10 mL比色管中，依次加入去离子水1 mL，3 mmol·L-1的FeSO4溶液1 mL，6 mmol·L-1的H2O2溶液1 mL。充分混匀，37 ℃水浴40 min，用去离子水补足至5 mL，525 nm下测定吸光值。H2O2溶液终浓度分别为(0，0.12，0.24，0.48，0.72，0.96，1.2，1.44 mmol·L-1)，绘制H2O2溶液终浓度与吸光值关系曲线。

水杨酸浓度对羟自由基检测的影响 分别吸取体积为(0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1，1.2，1.4 mL)的6 mmol·L-1水杨酸溶液于10 mL比色管中，依次加入去离子水1 mL，3 mmol·L-1FeSO4溶液1 mL，6 mmol·L-1的H2O2溶液1 mL，充分混匀，37 ℃水浴40 min，用去离子水补足到5 mL，525 nm下测定吸光值。水杨酸溶液终浓度分别为(0，0.12，0.24，0.48，0.72，0.96，1.2，1.44 mmol·L-1)，绘制水杨酸溶液终浓度与吸光值关系曲线。

羟自由基的清除能力测定 实验设样品组、对照组和空白组。分别配制质量浓度为50，100，200，300，400，600，800，1 000 μg·mL-1的抗坏血酸和谷胱甘肽溶液，乌骨鸡蛋清酶解物和普通鸡蛋清酶解物溶液质量浓度分别为0.125，0.25，0.5，1，2，3，4 mg·mL-1。反应总体积为4 mL；样品组在比色管中依次加入3 mmol·L-1FeSO4溶液1 mL，6 mmol·L-1H2O2溶液1 mL，37 ℃水浴10 min，再加入样品溶液1 mL和6 mmol·L-1的水杨酸溶液1 mL，37 ℃水浴40 min，去离子水定容到5 mL，525 nm下测定吸光值。空白组用1 mL去离子水代替H2O2溶液；对照组用1 mL去离子水代替样品溶液。按下式计算各样品羟自由基清除率(v)%：

式中：Ai表示测定样品组吸光值；Aj表示空白组吸光值；A0表示对照组吸光值。分别以样品浓度为横坐标，羟自由基清除率为纵坐标，建立样品浓度与DPPH自由基清除率的量效关系图，计算出羟自由基半数清除浓度(IC50)。

1.2.4 超氧阴离子自由基清除实验

参考文献[16]，分别考察反应体系pH值、反应温度、邻苯三酚浓度对邻苯三酚自氧化速率的影响，筛选出最佳实验条件。

pH值对邻苯三酚自氧化速率的影响 在4只10 mL比色管中分别加入pH为(6.8，7.5，8.2，9.0)的Tris-HCl缓冲溶液2.5 mL、加入去离子水2 mL，25 ℃水浴20 min，立即加入预先25 ℃保温150 μL的6 mmol·L-1邻苯三酚溶液，迅速倒入比色皿中，320 nm下测定记录初始吸光值A1。每隔0.5 min测定吸光值，记录3.5 min钟内吸光值A0，计算速率Vt。

反应温度对邻苯三酚自氧化速率的影响 在4只10 mL比色管中依次加入pH 8.2的Tris-HCl缓冲溶液2.5 mL、再加入去离子水2 mL，分别(25，30，37，42 ℃)水浴20 min，立即加入预先25 ℃保温150 μL的6 mmol·L-1邻苯三酚溶液，迅速倒入比色皿中，320 nm下记录初始吸光值A1。每隔0.5 min测定吸光值，记录3.5 min钟内吸光值A0，计算速率Vt。

邻苯三酚浓度对自氧化速率的影响 在4只10 mL比色管中依次加入pH 8.2的Tris-HCl缓冲溶液2.5 mL、再加入去离子水2 mL，25 ℃水浴20 min，立即分别加入预先25 ℃保温的(100，150，200，300 μL)的6 mmol·L-1邻苯三酚溶液，迅速倒入比色皿中，320 nm下测定记录初始吸光值A1。每隔0.5 min测定吸光值，记录3.5 min钟内吸光值A0，计算速率Vt。自氧化速率计算公式如下：

式中：A0为终止测定吸光值；A1为初始测定吸光值；t2终止测定时间；t1为初始测定时间。分别以反应时间为横坐标，吸光值为纵坐标，建立反应时间与吸光值关系图，计算邻苯三酚自氧化速率。

超氧阴离子自由基的清除能力测定 参照Alashi[17]方法，并按照1.2.4筛选的实验条件进行测定。实验设样品组、空白组和对照组。分别配制质量浓度为50，100，200，300，400、600，800，1000 μg·mL-1的抗坏血酸和谷胱甘肽溶液，乌骨鸡蛋清酶解物和普通鸡蛋清酶解物溶液质量浓度分别为0.125，0.25，0.5，1，2，3，4 mg·mL-1。反应体系总体积为4.5 mL，样品组比色管中依次加入Tris-HCl缓冲溶液2.5 mL，样品溶液0.5 mL，去离子水1.5 mL。混合均匀后，25 ℃水浴保温20 min。取出混合液，加入6 mmol·L-1的邻苯三酚溶液150 μL，迅速混匀倒入比色皿中，在320 nm下测定初始吸光值，并每隔30 s记录吸光值，测定3.5 min内吸光值。对照组用0.5 mL去离子水代替样品溶液。各样品的抗氧化能力用半数清除浓度(IC50)表示。超氧阴离子清除率(u)计算如下式：

超氧阴离子自由基清除率(u)%=

式中△A0/△t：邻苯三酚自氧化时反应速率；△A1/△t：加入样品液后邻苯三酚自氧化时反应速率。分别以样品浓度为横坐标，超氧自由基清除率为纵坐标，建立样品浓度与超氧自由基清除率的量效关系图，计算出超氧自由基半数清除浓度(IC50)。

1.2.5 数据分析

采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析IC50值，图形采用Origin 2018软件绘制。

2 结果与分析

2.1 蛋清酶解物DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是人工合成的、具有单电子、以氮为中心的顺磁化合物[18]。DPPH法是常用的一种作为评价天然抗氧化剂自由基清除能力方法[19]。DPPH在水及低浓度乙醇中溶解度较差，而蛋清酶解物是包含有大分子的一类复杂混合物，在高浓度乙醇溶液条件下容易发生沉淀，沉淀后则会影响DPPH测定结果。因此需要选择合适的乙醇浓度，使反应体系保持样品和DPPH的溶解。如图1、2所示，预试验表明：在乙醇浓度为0～40%范围内，两种蛋清酶解物均无沉淀产生。以40%乙醇配的DPPH溶液在0.01～0.08 mmol·L-1范围内稳定无沉淀，且DPPH摩尔浓度与吸光值呈良好的线性关系(y=12.051 6x-0.134 2，R2=0.997 1)。因此，选取40%乙醇溶液为样品及DPPH的配制溶剂较适宜。

抗坏血酸对DPPH自由基有较强的清除作用，如图3(b)所示，在10～50 μg·mL-1范围内质量浓度与清除率几乎呈线性关系，线性方程为Y=1.822 89x-6.604 38(R2=0.990 2)，抗坏血酸对DPPH自由基IC50为0.031 mg·mL-1。图3(a)所示，乌鸡蛋清和普通蛋清酶解物质量浓度在0.25～4 mg·mL-1范围里，乌鸡蛋清酶解物DPPH自由基清除速率约是普通蛋清酶解物的2倍；乌骨鸡蛋清酶解物质量浓度在4 mg·mL-1时，清除曲线出现拐点，曲线斜率变小，表示DPPH清除速率减缓。普通鸡蛋清酶解物质量浓度在6 mg·mL-1时，清除曲线出现拐点，曲线的斜率变小，DPPH清除速率减缓，可能是由于蛋清酶解物是一种含有多种抗氧化活性成分的混合物质。在线性范围内得出乌骨鸡蛋清酶解物和普通鸡蛋清酶解物的DPPH自由基IC50分别为0.732，2.013 mg·mL-1，可见乌骨鸡蛋清酶解物的DPPH自由基清除效能明显强于普通鸡蛋清酶解物。

2.2 蛋清酶解物羟自由基清除能力

Fenton反应中H2O2在Fe2+的催化下生成的·OH[15]。水杨酸法测定羟自由基含量是利用水杨酸捕获羟自由基生成有色物质2,3-二羟基苯甲酸，通过比色测定2,3-二羟基苯甲酸含量，从而间接反应·OH含量[20]。反应原理如下：

如图4所示，在H2O2溶液和水杨酸溶液足量的条件下，Fe2+离子浓度在0～0.72 mmol·L-1范围内，在该反应体系下2,3-二羟基苯甲酸生成量与铁离子浓度呈良好的线性关系，Y=1.012 6x+0.058 7(R2=0.995 9)。为使蛋清酶解物羟自由基IC50与DPPH自由基IC50在相同数量级，可选取0.6 mmol·L-1作为反应体系亚铁离子终浓度。即在反应体系中加入1 mL的 3 mmol·L-1FeSO4溶液。

确定Fe2+离子浓度为0.6 mmol·L-1，确保反应体系足量的水杨酸溶液。如图5(a)，在H2O2溶液在0～0.48 mmol·L-1范围内，吸光值随着H2O2浓度的增加而增大；当反应体系中H2O2浓度在大于0.48 mmol·L-1，吸光值不再增加。可知，终浓度为0.48 mmol·L-1H2O2溶液已经可以使反应体系产生足量的·OH。实验表明，Fe2+离子是影响·OH生成量的重要因素，H2O2不稳定、受热易分解，故难以精确定量。为使反应体系产生足量的·OH，则选0.6 mmol·L-1作为该反应体系H2O2终浓度。即在反应体系中加入1 mL的 6 mmol·L-1H2O2溶液。

确定Fe2+离子终浓度为0.6 mmol·L-1，H2O2终浓度为0.6 mmol·L-1。如图5(b)所示，反应体系中水杨酸终浓度范围在0.12～0.96 mmol·L-1间，吸光值随着水杨酸浓度的增加而增大；当水杨酸浓度在大于0.96 mmol·L-1，吸光值不再增加。为了保证显色完全，反应体系需要足量水杨酸溶液，则选取1.2 mmol·L-1为水杨酸溶液终浓度。即在反应体系中加入1 mL的6 mmol·L-1水杨酸溶液。

·OH作为氧化活性很强的自由基能严重损害相邻间生物分子功能和结构，而引起细胞衰老、癌症和其他多种疾病[5]。从这一角度来说，实现对·OH的清除，是机体预防疾病的有效手段之一。由图6(a)所示，在50～1 000 μg·mL-1范围内，对照品抗坏血酸和谷胱甘肽溶液质量浓度与·OH清除率呈量效关系。在线性范围内，抗坏血酸和谷胱甘肽羟自由基IC50分别为：0.179，0.473 mg·mL-1。图6(b)所示，样品浓度在0.125～1 mg·mL-1内，乌骨鸡蛋清酶解物·OH清除速率约是普通蛋清酶解物的1.5倍。蛋清酶解物浓度在1～4 mg·mL-1范围，两种蛋清酶解物·OH清除率随样品浓度增加而变大，但·OH清除速率均呈现减缓趋势，可能是由于蛋清酶解物为一种含有多种抗氧化活性成分的混合物，高抗氧化活性成分占比较少，弱抗氧化活性成分占比多。乌骨鸡蛋清酶解物和普通蛋清酶解物羟自由基IC50分别为：1.986，5.158 mg·mL-1。综上所述，乌骨鸡蛋清酶解物·OH清除效能优于普通鸡蛋清酶解物。

2.3 蛋清酶解物超氧自由基清除能力

反应体系pH值对邻苯三酚自氧化速率有显著地影响，对自氧化曲线线性保持时间影响较小。如图7(a)所示，PH值为6.8或7.5时，自氧化速率小于0.02 ΔA/min，pH值为8.2或9时自氧化速率显著加快，自氧化速率分别为0.165 ΔA/min，0.246 1 ΔA/min，但pH=9时的自氧化曲线线性保持时间短于pH=8.2线性保持时间，且pH=8.2更接近人体生理酸碱度。所以选择pH=8.2作为反应体系的pH值更适宜，pH值误差不超过±0.01。

如图7(b)所示，反应温度在25 ℃～42 ℃范围内，温度对邻苯三酚自氧化速率的影响要远小于pH值和邻苯三酚浓度对自氧化速率的影响。吸光值变化速率小于0.2 ΔA/min，更加有利于实验数据测定，因此选择25 ℃作为反应温度。

邻苯三酚浓度对自氧化速率有显著的影响，如图8所示，邻苯三酚浓度在0.13～0.4 mmol·L-1范围里，自氧化速率随着浓度增加而增大，为使蛋清酶解物超氧自由基IC50与DPPH自由基IC50在相同数量级以便比较，则选择0.2 mmol·L-1作为反应体系的终浓度较适宜。

超氧阴离子自由基作为多种活性氧自由基的前体，能对机体造成损害。人体中可产生氧化性较弱超氧自由基，但它会分解成氧化性很强的单线态自由基，而单线态氧自由基可造成脱氧核糖核酸的损伤[21]。如图9(b)所示，质量浓度50～600 μg·mL-1在范围里，抗坏血酸与谷胱甘肽对超氧自由基清除能力较强且呈量效关系，抗坏血酸与谷胱甘肽超氧自由基IC50分别为0.086，0.171 mg·mL-1。如图9(a)所示，蛋清酶解物质量浓度在0.25～1 mg·mL-1范围内，乌骨鸡蛋清酶解物超氧自由基清除速率约是普通蛋清酶解物的1.2倍；在蛋清酶解物质量浓度在1～8 mg·mL-1范围里，且随着蛋清酶解物质量浓度的增加，超氧自由基清率同时在增加。蛋清酶解物在1 mg·mL-1时，两条清除曲线均出现拐点，超氧自由基清除速率减缓，且乌骨鸡蛋清酶解物超氧自由基清除效能优于普通蛋清酶解物。乌骨鸡蛋清酶解物和普通蛋清酶解物超氧自由基IC50分别为3.825，10.557 mg·mL-1。综上所述，乌骨鸡蛋清酶解物和普通鸡蛋清酶解物均有一定的超氧自由基清除能力，且相同浓度下乌骨鸡蛋清酶解物自由基清除效能明显要强于普通鸡蛋清酶解物。

3 结果与讨论

本文在对DPPH法、水杨酸法、邻苯三酚法清除自由基实验优化条件下，对乌骨鸡蛋清和普通蛋清酶解物进行抗氧化活性差异评价。结果显示，两种蛋清酶解物的浓度与抗氧化能力在一定浓度下有量效关系。乌骨鸡蛋清酶解物和普通蛋清酶解物在对DPPH自由基IC50为0.732，2.013 mg·mL-1；羟自由基IC50为1.986，5.158 mg·mL-1；超氧阴离子自由基IC50分别为:3.825，10.557 mg·mL-1。半数清除浓度越低，自由基清除能力越强，则抗氧化活性能力越强。乌骨鸡蛋清的抗氧化活性要显著优于普通鸡蛋清。

产蛋鸡种属差异及饲养方式是影响鸡蛋清蛋白质与氨基酸组成的重要因素，蛋清酶解产物的抗氧化性能在较大程度上受酶解底物蛋清蛋白质结构、氨基酸的种类、组成的影响[22-23]。乌骨鸡蛋中富含谷氨酸、丙氨酸、精氨酸、天门冬氨酸等多种氨基酸，蛋清、蛋黄、全蛋中氨基酸均比普通鸡蛋高，乌骨鸡蛋中各必需氨基酸占总氨基酸的质量分数都超过标准参考值[4]。乌骨鸡蛋清酶解物抗氧化能力强于普通蛋清酶解物也表明乌骨鸡蛋清蛋白质具有较高的特殊性和开发利用价值。目前乌骨鸡蛋开发研究程度较低，本研究为乌骨鸡蛋源功能食品的开发应用提供了理论依据。