基于网络药理学探讨桃红四物汤治疗骨质疏松症的主要活性成分及药理作用机制

樊梅 唐 芳 马武开 兰维娅

【摘 要】目的：从网络药理学角度研究桃红四物汤治疗骨质疏松症的主要活性成分及多维药理作用机制。方法：从中药系统药理学数据库和分析平台中提取桃红四物汤的化学成分，以口服生物利用度OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18筛选活性成分，通过该数据库提取活性成分作用靶点，以GeneCards和OMIM在线分析平台挖掘靶点相关疾病，采用Cytoscape 3.7.2软件构建活性成分?作用靶点网络，String10.0构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，最后通过基因本体（GO）和基因组百科全书（KEGG）富集分析桃红四物汤治疗骨质疏松症的药理作用机制。结果：共筛选得到桃红四物汤69个活性成分，涉及5346个作用靶点，主要涉及破骨细胞分化，激素，相关炎症因子，甲状旁腺激素的合成、分泌及作用等生物过程，通过调节白细胞介素-17、辅助性T细胞17、T细胞受体、Toll样受体、雌激素、丝裂原活化蛋白激酶、PI3K-Akt、甲状腺激素、FoxO、Wnt等信号通路发挥治疗骨质疏松症的作用。结论：本研究体现了桃红四物汤多成分?多靶点?多途径的作用特点，为进一步开展桃红四物汤治疗骨质疏松症作用机制的研究提供了新的思路与方法。

【关键词】 骨质疏松症;网络药理学;桃红四物汤;活性成分;作用机制

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种全身性骨骼疾病，表现为骨组织微结构退行性变和低骨量，引起骨的脆性和骨折的敏感性增加。各年龄段骨质疏松性骨折的发病率都在增加，女性患骨折的风险是男性的2倍。随着我国社会进入人口老龄化阶段，本病的发病率将持续升高[1]。OP主要以双膦酸盐类作为一线治疗药物，其次是核转录因子-κB受体活化因子配体（RANKL）抑制剂。甲状旁腺素（甲状旁腺激素的一个片段）是只有经批准的合成代谢剂，激素替代疗法（HRT）包括大量雌激素或雌激素加孕激素联合制剂，其中一些被批准用于预防绝经后骨折高危妇女的OP，补充钙和维生素D经常被认为是治疗OP的辅助手段[2]。尽管这些策略对OP有很好的疗效，但研究显示长期服用这些药物具有较大的不良反应，如对胃肠道损害、耐药等。因此，寻求一种安全有效治疗OP的药物具有重要的临床意义[3]。

OP属中医学“骨痿”“虚劳”“骨痹”“骨枯”等范畴。许多中草药及经典古方在辨证论治基础上治疗OP得到了良好的应用，在临床上取得了较好的疗效[4]。桃红四物汤最早出自清·吴谦所著《医宗金鉴》，是由四物汤加桃仁、红花而成，也称加味四物汤，全方有活血化瘀、养血补血的作用，是治疗血瘀证的常用方。四物汤中当归、川芎为血中之气药，熟地黄、白芍为血中之血药，加上桃仁、红花的活血作用，全方具有养血而不滞血、活血而不伤血的功效[5]。杨国柱等[6]利用泼尼松诱导斑马鱼OP模型评价桃红四物汤抗OP作用的实验研究发现，桃红四物汤对斑马鱼OP模型有明显的治疗作用。此外，很多研究都表明，桃红四物汤具有治疗OP的作用，这也体现了中医药治疗OP具有很大的优势及潜力。桃红四物汤在中医药治疗OP的临床实践中虽得到广泛的运用，但其药效物质基础及具体作用机制尚不清楚，这是限制其临床广泛运用的关键问题。因此，基于桃红四物汤所含有效成分的复杂性、多样性，本研究采用网络药理学方法探讨桃红四物汤对OP的药理作用机制，并基于药物、靶点和OP靶点之间的关系建立药理学网络，希望能为深入了解桃红四物汤治疗OP提供一定的参考依据。

1 研究方法

1.1 桃红四物汤所含化合物的收集与筛选 通过中药系统药理学数据库和分析平台（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSP）收集桃红四物汤中桃仁、红花、当归、川芎、白芍、熟地黄6味药的成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为限定条件对所收集到的化合物进行筛选。

1.2 桃红四物汤所含化合物作用靶点的预测 对1.1中化合物的作用靶点进行预测。

1.3 OP发病靶点检索及桃红四物汤作用OP相关靶点的预测 通过UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/）将所得药物靶点ID转换成GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）的基因名称。以“osteoporosis”作为关键词，在GeneCards数据库、OMIM数据库收集与OP相关的基因，取得分≥0.4的靶点，将挖掘得到的OP相关基因与桃红四物汤靶点基因互相映射筛选出共同靶点，获得桃红四物汤治疗OP的作用靶点。

1.4 桃红四物汤所含化合物作用OP相关靶点相互作用的网络构建 将每个化合物与其作用的OP靶点相联系，通过Cytoscape 3.7.2软件进行桃红四物汤的成分-OP相关靶点相互作用网络的构建并绘制网络图，利用软件中的Network Analyzer插件分析网络节点度和介数中心度。

1.5 桃红四物汤对OP作用靶点的蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建 为了说明靶点蛋白在系统水平上的作用，将桃红四物汤相关靶点基因上传至在线String10.0软件（https：//string-db.org/），选择研究物种为人类，设置靶点之间最低要求联系分数为0.4，并隐藏不与其他靶点联系的靶点，构建由导入基因表达产物组成的PPI网络，并且利用R语言3.6.1软件（https：//www.r-project.org/）对PPI网络中的蛋白绘制条形图。

1.6 桃红四物汤治疗OP预测靶点富集分析 运用DAVID数据库，以P < 0.05作为筛选条件获得靶点蛋白进行基因本体（GO）功能富集分析及基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，包括生物过程、细胞组成和分子功能3个部分。

2 结 果

2.1 活性化合物的筛选 为了提供更准确的结果，本研究挑选TCMSP中OB≥30%、DL≥0.18的化合物，共检索出730个化合物，其中桃仁66个、红花189个、当归125个、川芎189个、白芍85个、熟地黄76个，通过筛选得出69个活性化合物，如谷甾醇α1、β-胡萝卜素、黄芩苷、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、槲皮素、豆甾醇、芍药总黄酮、芍药苷、儿茶素等。

2.2 桃红四物汤所含化合物作用靶点的预测 对2.1中化合物的作用靶点进行预测，共得到5346个作用靶点。

2.3 桃红四物汤靶点与OP靶点相互作用韦恩图 依据Relevance score≥4标准，按分子-靶蛋白对接结果筛选出相关靶蛋白，利用UniProt数据库转换成对应的基因名称，如遇PBD ID对应多个基因，则核对靶蛋白内容选择基因，确保1个蛋白对应1个基因。结果，共得到199個靶基因，再依据GeneCards数据库、OMIM数据库挖掘得到OP相关基因615个，最后将桃红四物汤活性成分-OP靶点相关基因映射，共发现41个共同基因，确定为桃红四物汤治疗OP的靶基因。见图1。

2.4 桃红四物汤靶点-OP相互作用网络 将候选化学成分与OP靶点通过Cytoscape 3.7.2建立桃红四物汤成分靶点-OP靶点群网络，得出桃红四物汤靶点-OP网络主要由56个节点（13个化合物节点，43个靶点节点）和115条边组成，其中菱形节点红色表示疾病OP，六边形紫色表示药物，黄色三角形节点表示桃红四物汤药物活性成分，圆形绿色节点表示桃红四物汤可能是通过这些基因治疗OP，连接化合物与靶点的每条边表示桃红四物汤活性成分与OP靶点之间的相互作用关系。见图2。在桃红四物汤靶点-OP靶点网络中，桃红四物汤中有13种主要成分作用于OP相关靶点，充分体现了其多成分、多靶点的作用特点。其主要的化合物有β-谷甾醇、木脂素、6-羟基山奈酚、黄芩素、槲皮素、β-胡萝卜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素、芍药苷、儿茶素、肉豆蔻碱等，这些药物的活性成分可能是治疗OP的物质基础。

2.5 靶点PPI网络、关键基因分析 PPI网络包含41个靶蛋白节点，共有403条相互作用连线。见图3。其中度值较大的有白细胞介素（IL）-6（度值 = 38）、IL-B（度值 = 35）、JUN（度值 = 32）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9，度值 = 30）、表皮生长因子（EGF，度值 = 28）、低聚果糖（FOS，度值 = 28）等，它们与其他蛋白相互作用，在该网络中发挥了关键作用。见图4。

2.6 GO生物过程分析 将41个靶基因在DAVID数据库进行GO生物过程富集，根据错误发现率（FDR） < 0.05筛选出62个GO生物过程。其中受体调节活性、DNA结合转录激活活性、RNA聚合酶Ⅱ特异性、受体配体活性、染色质结合活性等位于GO生物过程富集的前面。见图5、图6。OP的发生、发展涉及蛋白质的活性、转录因子的活性、DNA及RNA的转录调节等生物过程，而桃红四物汤可通过调节以上生物过程治疗OP。

2.7 KEGG信号通路分析 通过DAVID数据库将桃红四物汤的41个靶基因在KEGG信号通路中富集，根据FDR < 0.05筛选出与OP密切相关的信号通路，包括IL-17、辅助性T细胞17（Th17）细胞、T细胞受体、Toll样受体、雌激素、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、PI3K-Akt、甲状腺激素、FoxO、Wnt等信号通路。其中每条通路都有相对应的通路图，涉及破骨细胞分化，激素，相关炎症因子，甲状旁腺激素的合成、分泌及作用等生物过程。由此推测，桃红四物汤可能主要通过调节以上关键基因，影响此类信号通路发挥治疗OP的作用。KEGG富集通路的柱状图，见图7。

3 讨 论

OP是一种以骨量减少、骨的微观结构破坏为主要特征的全身性疾病，临床上以全身骨痛及易于发生骨折为主要表现，尤以老年人及绝经后妇女多见，随着我国人口老龄化加快，其分型又以绝经后OP为常见[7-8]。季兆洁等[9]发现，桃红四物汤具有显著的促进骨折愈合作用，促进骨痂微血管的新生，显示出良好的祛瘀生新作用。中医药治疗OP具有价格低廉、剂型丰富、不良反应小、依从性好等优势，在治疗早中期OP方面发挥着不可替代的作用[10]。而网络药理学通过对中药的收集整合，建立了多种中药数据库，以可视化的形式将各个药物与疾病之间的关系系统地呈现出来[11]。从本研究结果来看，桃红四物汤中关键的活性成分、基因参与并调控了OP的进程，与目前已有的关于桃红四物汤治疗OP的研究相一致，为桃红四物汤“多成分—多靶点—多疾病”治疗OP的机制提供了参考。

从OP与桃红四物汤的共同靶点来看，OP与桃红四物汤相关的活性成分-潜在靶点网络中包含41个靶点，其中度值较大的有IL-6、IL-B、JUN、MMP-9、EGF、FOS等，推测桃红四物汤有效成分可能通过抑制上述靶点发挥作用。如血清IL-6可能与OP的发病有关[12]，MMP-9是破骨细胞前体的重要调节因子[13]。

本研究初步筛选出桃红四物汤治疗OP的活性成分有β-谷甾醇、木脂素、6-羟基山奈酚、黄芩素、槲皮素、β-胡萝卜素、山奈酚、木犀草素、槲皮素、芍药苷、儿茶素、肉豆蔻碱等。β-谷甾醇是一种植物甾醇，在体外和体内研究中被报道为具有抗炎、抗血管生成和降低胆固醇作用;槲皮素为一种黄酮类化合物，据报道，槲皮素可以降低因小鼠卵巢切除和骨修复而导致的骨完整性丧失。研究发现，这两种药物具有改善骨脆性和骨折的药理作用，能逆转体内外雌激素调节引起的骨重塑的衰弱状态，维持钙、磷水平和骨完整性[14]。有研究者利用代谢组学的方法，评价木脂素对去卵巢OP模型大鼠的疗效和治疗靶点，最终鉴定出16种潜在的生物标志物，通过影响内源性相关代谢机制，为绝经后OP的治疗提供了药理依据[15]。付方胜等[16]实验提示，黄芩素可以通过抑制RANKL诱导的破骨细胞分化和骨吸收功能，预防破骨细胞增强导致的OP;此外，它还可通过激活mTORC1信号通路刺激MC3T3-E1细胞分化为成骨细胞[17]。

山奈酚是一种天然黄酮类化合物，从山奈酚根状茎中提取，研究发现，山奈酚对去卵巢大鼠OP的防治作用是使骨密度有显著提高，明显抑制大鼠尿液中骨钙和磷的流失，能够显著抑制去卵巢大鼠血清中酒石酸酸性磷酸酶和组织蛋白酶K的活性，改善OP大鼠骨小梁形态结构[18-19]。β-胡萝卜素能促进成骨细胞的早期分化，维持骨转换的正平衡[20]。木犀草素是一种具有抗氧化活性的植物类黄酮。研究发现，其可以通过减轻氧化应激促进成骨细胞增殖，并通过调节ERK/LRP-5/GSK-3β途径促进成骨细胞分化，在糖皮质激素性OP的治疗中发挥重要作用[21]。芍药苷是一种天然产物，能提高成骨细胞活性，抑制破骨细胞活性，从而减少去卵巢引起的OP[22]。综上所述，桃红四物汤的有效成分之间不仅存在紧密的协同关系，而且其作用靶点也在整个疾病进程中发挥着重要作用。

从通路富集结果分析可知，桃红四物汤治疗OP核心基因的KEGG通路主要涉及IL-17、Th17细胞、T细胞受体、Toll样受体、雌激素、MAPK、PI3K-Akt、甲状腺激素、FoxO、Wnt、AGE-RAGE等。其中每条通路都有相对应的通路图，涉及破骨细胞分化，激素，相关炎症因子，甲状旁腺激素的合成、分泌及作用等生物过程。

根据本研究结果，桃红四物汤多靶点、多通路治疗OP的机制得到初步验证，网络药理学分析结果从另一方面也说明了引起OP因素多且复杂，为从分子水平方向进一步揭示桃红四物汤治疗OP的潜在化学成分及作用机制，为后期药物研发及疾病治疗提供一定的理论依据。

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收稿日期：2020-02-29;修回日期：2020-04-16