水包油包水双重保鲜乳液对西兰花贮藏品质的影响

路玲，方艺达，李莉，徐艳群,2，罗自生,2,3,4,5*

（1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，杭州310058；2.浙江大学宁波研究院，浙江 宁波315100；3.农业农村部农产品产后处理重点实验室，杭州310058；4.智能食品加工技术与装备国家地方联合工程实验室，杭州310058；5.浙江大学馥莉食品研究院，杭州310058）

西兰花（Brassica oleracea L.var.botrytis L.），又称青花菜，营养成分丰富，富含维生素C和蛋白质以及多酚、黄酮类等抗氧化活性物质，被誉为“蔬菜皇冠”。西兰花中的硫代葡萄糖苷、萝卜硫素等活性物质具有预防癌症、降血脂和增强免疫力的功效[1-2]。西兰花属于呼吸跃变型果实，采后西兰花在常温下呼吸作用旺盛，易发生组织褐变、病原菌及附生微生物生长繁殖，引发霜霉病、黑腐病、软腐病、灰腐病等[3]。这些病变造成西兰花褪绿黄化、营养成分流失，降低其食用及商业价值[4]，导致西兰花货架期缩短。因此，如何延长采后西兰花货架期成为国内外的研究热点。

目前，国内外鲜切西兰花保鲜技术主要有气调包装、微波处理、乙醇处理、短波紫外线（UV-C）处理、杀菌剂处理和涂膜等，其中涂膜保鲜由于操作简单、安全性较高，受到越来越多的关注。林本芳等[5]的研究表明，冷藏结合1 200 mg/L 纳他霉素处理对西兰花的成熟衰老有较好的抑制作用。肉桂精油因含有肉桂醛可起到抗菌、抗氧化的作用。黄文部等[6]研究了肉桂、牛至、茴香3种精油对鲜切西兰花贮藏品质的影响，结果表明，肉桂精油对鲜切西兰花的保鲜效果最好。王磊明等[7]研究表明，1.2%的壳聚糖和肉桂精油复合制成的保鲜涂膜对蓝莓保鲜效果显著。而芸苔素内酯不仅是一种无毒无害的天然植物激素，适当浓度的外源芸苔素内酯处理还能有效缓解生物、非生物胁迫对植物造成的氧化损伤，延长果蔬货架期。乔永祥等[8]研究了5、15 μmol/L 24-油菜素内酯对鲜切生菜褐变的影响，结果表明，芸苔素内酯可有效抑制鲜切生菜的褐变。但在常温条件下，肉桂精油易挥发，芸苔素内酯在中性环境中也易水解[9]，保鲜效果有限；因此，本研究以新鲜西兰花为试验材料，使用包埋有肉桂精油和芸苔素内酯的水包油包水（water/oil/water,W/O/W）双重保鲜乳液对采后西兰花进行涂膜保鲜。W/O/W型乳液保鲜剂由内水相、油相和外水相3部分组成，其中：内水相中包埋有植物激素芸苔素内酯、明胶、氯化钠和抗坏血酸，油相中包含橄榄油和肉桂精油，外水相中包含乳清蛋白和果胶。W/O/W双重保鲜乳液具有独特的“两膜三相”的多隔室结构[10]，可有效缓释包埋在其中的抗菌物质和植物生长调节剂。本研究旨在为西兰花的贮藏保鲜提供新的理论依据和技术方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验材料为西兰花，购自浙江省杭州市三墩镇第三农贸市场。

试验试剂：肉桂精油（纯度为100%），购自广州高岛化妆品有限公司；芸苔素内酯，购自合肥博美生物科技有限责任公司；乳清蛋白、果胶、橄榄油、氯化钠、抗坏血酸、明胶、吐温－80（聚山梨酯－80）等，购自上海国药集团化学试剂有限公司；叶绿素酶试剂盒、脱镁螯合酶试剂盒，购自齐一生物科技（上海）有限公司。

试验仪器：恒温培养箱，购自浙江省宁波塞福实验仪器有限公司；恒温水浴锅，购自上海亚荣生化仪器厂；METTLER TOLEDO XS105 分析天平，购自瑞士Mettler Toledo 公司；TGL-16M 台式高速冷冻离心机，购自湖南湘仪离心机仪器有限公司；MULTISKAN MK3 型酶标仪，购自赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；1100系列高效液相色谱仪（配光电二极管阵列检测器），购自美国安捷伦公司；超声波细胞粉碎机，购自浙江省宁波新芝生物科技股份有限公司；美能达CR-400 色差仪，购自日本KONICA 公司；DDS-320 电导率仪（山东省青岛明博环保科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 W/O/W 双重保鲜乳液的配制

取20 mg 芸苔素内酯，溶于一定量乙醇中并定容到100 mL，配制成200 mg/L 的芸苔素内酯母液，置于4 ℃冰箱中保存，备用。取20 mL 芸苔素内酯母液，稀释至50 mL，加入0.5 g 明胶、50 mg NaCl、5 mg抗坏血酸，加热溶解，为一水相；在30 mL橄榄油（油相）中加入0.5 g疏水性表面活性剂，并加入精油，混合后加热，用磁力搅拌器搅拌15 min；通过水相分散到油相中制备水包油（water/oil,W/O）乳状液，初始的W/O乳液使用磁力搅拌器搅拌2 min，然后超声4 min（工作时间3 s，休息时间3 s）。制备的W/O乳状液在4 ℃冰箱中保存30 min；取10 mL W/O乳液在室温（25±2）℃条件下添加到30 mL 二水相[由4%的乳清蛋白+阿拉伯胶（质量比为1∶3、1∶1、3∶1）或乳清蛋白+果胶（质量比为1∶3、1∶1、3∶1）组成]中，并加入0.3 g亲水性表面活性剂、3 mg抗坏血酸和30 mg NaCl，使用磁力搅拌器搅拌，10 min后超声2 min（工作时间3 s，休息时间3 s），即得到W/O/W双重保鲜乳液。

1.2.2 肉桂精油/芸苔素内酯乳液的配制

肉桂精油/芸苔素内酯乳液是由肉桂精油、表面活性剂吐温－80及芸苔素内酯混合而成的乳浊液，各物质的质量浓度与W/O/W型乳液保鲜剂一致。

1.2.3 样品前处理

挑选无病虫害，成熟度、大小基本一致的西兰花作为试验材料，使用锋利、洁净的不锈钢刀切割，切分成直径为3～4 cm 的花蕾簇，以不易引起植株损伤。随机选取鲜切西兰花样本，备用。试验设置对照组（以清水为保鲜剂）、双重乳液组（以制备的W/O/W复合乳液为保鲜剂）和乳液组（以肉桂精油/芸苔素内酯乳液为保鲜剂）。分别用不同处理组的保鲜剂浸泡西兰花样本10 s 后捞出，自然风干；以5～6个西兰花的花蕾簇为一组分装入自封袋（正反面各扎10 个孔）中，每组10 袋，共3 组，排列于塑料托盘中，置于25 ℃培养箱中贮藏。

1.2.4 品质指标测定

通过美能达CR-400 色差仪测量明度（L*）和黄蓝（b*）值。每组选取3 个西兰花花簇，在每个花簇上随机选择10个不同的区域进行测量。

相对电导率的测定采用浸泡法，使用DDS-320电导率仪。

丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量测定：称取1 g 西兰花样品，加5 mL 100 g/L 三氯乙酸研磨，匀浆后，于4 ℃、1.2×104g 条件下离心10 min，收集上清液，低温保存，备用。取2 mL上清液（对照空白管中加入2 mL 100 g/L三氯乙酸溶液代替提取液），加入2 mL 0.67%硫代巴比妥酸，混合后在沸水浴中煮沸20 min，冷却后再次离心，上清液分别在450、532和600 nm处测定吸光度值，重复3次。

叶绿素含量测定：将来自每个托盘的5 g 冷冻样品在液氮中研磨，在黑暗中加入10 mL 80%冷却丙酮，提取30 min。于4 ℃、1.2×104g 条件下离心10 min，收集上清液；重复该过程直至残余物变白。最后，使用80%丙酮将体积补足至25 mL，并通过酶标仪测量在663 和645 nm 处的吸光度值。总叶绿素含量=20.29 D663nm+8.05 D645nm。

总酚、总黄酮含量测定：称取2.0 g西兰花，加入少许预冷的1%盐酸-甲醇溶液，在冰浴条件下研磨匀浆后，转入20 mL刻度试管中。用1%盐酸-甲醇溶液冲洗研钵，一并转移到试管中，定容至刻度，混匀。于4 ℃冰箱中避光提取20 min，其间摇动数次，收集滤液，待用。以1%盐酸-甲醇溶液做空白参比调零，取滤液，分别于波长280、325、600和530 nm处测定其吸光度值，重复3次。以每克新鲜果蔬组织在波长280 nm 处的吸光度值表示总酚含量。在波长325 nm处的吸光度值表示总黄酮物质含量。用不同浓度的没食子酸制作标准曲线，计算总酚物质含量。用不同浓度的芦丁制作标准曲线，计算总黄酮含量。

菌落总数计算参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[11]；维生素C含量测定参照文献[12]，稍做修改。

硫代葡萄糖苷含量测定采用分光光度法。绘制葡萄糖标准溶液。称取2 份西兰花各0.5 g，分别置于2 支25 mL 刻度试管中，各加0.1 g 氟化钠。其中一支试管中加入沸水20 mL，立即加热至沸腾并保持10 min。另一支试管中加入37 ℃蒸馏水20 mL，置于37 ℃水浴中保温酶解1 h，完成水解后加热至沸腾并保持10 min。在2 支试管中分别加入6滴中性醋酸铅，以沉淀其中的蛋白质和色素类物质；加入适量硫酸钠溶液消除过量的醋酸铅；最后加入蒸馏水定容至25 mL，用滤纸过滤，得滤液于试管中。各取0.5 mL 滤液，向其中加入0.5 mL 蒸馏水，3 mL 3，5-二硝基水杨酸溶液，混匀，于沸水浴中保温10 min后取出，冷却至室温后定容至10 mL，于530 nm处测吸光度值。计算公式为：

式中：m1为灭酶管从标准曲线上查得的相应葡萄糖量，mg；m2为酶解管从标准曲线上查得的相应葡萄糖量，mg；m 为样品质量，g；2.207 是硫代葡萄糖转化为硫代葡萄糖苷的系数；436.5是硫代葡萄糖苷相对分子质量，g/mol。

叶绿素酶、脱镁螯合酶活性根据酶联免疫试剂盒说明书测定。

1.2.5 数据处理

所有试验重复3 次。试验数据采用Excel 2010和SPSS 20.0 统计分析软件进行差异显著性分析，采用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 W/O/W 双重保鲜乳液对西兰花在贮藏中基本品质指标变化的影响

L*、b*分别表示西兰花的明度和黄蓝色调，L*值越大表明西兰花越倾向于白色，b*值越大表明西兰花表面黄色沉积越为明显。如图1A～B所示，不同保鲜剂处理的西兰花L*、b*值均随着贮藏时间的延长呈逐渐上升的趋势。其中：W/O/W双重乳液涂膜处理显著延缓了西兰花L*值的升高，贮藏期间L*值仅为39.58～48.12，而对照组和肉桂精油/芸苔素乳液组则分别高达52.55 和57.64。W/O/W 双重乳液涂膜处理的西兰花b*值升高最慢，说明双重乳液显著延缓了西兰花在贮藏过程中的黄化；肉桂精油/芸苔素内酯乳液涂膜处理的西兰花在前4 d也显著延缓了西兰花的黄化，但精油和芸苔素内酯随时间而挥发，无法保持长时间的保鲜作用，因此，在贮藏的最后2 d，西兰花b*值迅速升高。上述试验结果表明，W/O/W 双重乳液可以很好地发挥缓释作用，延长涂膜的有效保鲜时间。

相对电导率和丙二醛（MDA）都可以反映细胞膜结构的完整性。从图1C 可以看出：经W/O/W 双重乳液处理的西兰花样品的相对电导率低于对照组和乳液组；贮藏第5天时，对照组、双重乳液组、乳液组的相对电导率分别为14.84%、12.77%、14.35%，说明W/O/W 双重保鲜乳液可以减轻西兰花在贮藏过程中细胞膜的损伤程度。由图1D 可见：MDA 含量为4～14 μmol/mL，各处理组西兰花MDA含量均逐渐上升，表明随贮藏时间延长西兰花成熟并逐渐腐烂[13]。W/O/W双重乳液处理能够延缓MDA含量的上升，与对照组差异显著（P＜0.05），表明其能够延缓西兰花的腐烂。

图1 在25 ℃贮藏过程中西兰花L*、b*、相对电导率和MDA含量的变化情况Fig.1 Changes of L*,b*,relative electronic conductivity and MDA content of broccoli during storage at 25 ℃

2.2 W/O/W 双重保鲜乳液对西兰花在贮藏中叶绿素及其相关酶活性变化的影响

叶绿素含量高低可反映西兰花的新鲜程度。由图2可知：贮藏期内W/O/W双重乳液组叶绿素含量下降最少；第5天时，叶绿素含量、叶绿素酶活性、脱镁螯合酶活性均为W/O/W双重保鲜乳液处理组＞肉桂精油/芸苔素内酯处理组＞对照组，且W/O/W双重保鲜乳液处理组与其他2 组间差异显著（P＜0.05）。

2.3 W/O/W 双重保鲜乳液对西兰花在贮藏中抗氧化活性变化的影响

总酚、总黄酮是西兰花中重要的抗氧化物质，是判断西兰花品质的重要指标。由图3 可知，西兰花在贮藏过程中总酚、总黄酮含量及1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）自由基清除率呈下降趋势。对于酚类物质，从第2 天开始肉桂精油/芸苔素内酯乳液处理组和对照组西兰花的总酚含量迅速下降，而W/O/W 双重保鲜乳液处理组总酚含量下降较为缓慢；对于总黄酮而言，W/O/W 双重保鲜乳液处理可以显著延缓其含量的下降（P＜0.05）；对于抗氧化活性，用DPPH 自由基清除率来表示，西兰花在贮藏过程中DPPH 自由基清除率呈下降趋势，从贮藏第2 天开始W/O/W 双重保鲜乳液处理组的下降趋势显著减缓（P＜0.05）。

2.4 W/O/W 双重保鲜乳液对西兰花在贮藏中菌落总数变化的影响

菌落总数表示贮藏过程中微生物生长繁殖情况，直接反映了果蔬的品质，是评价果实质量优劣的一项重要指标。本研究中，W/O/W 双重保鲜乳液所包埋的肉桂精油中含有的肉桂醛可以抑制或杀死生长在西兰花中的微生物[14]。从图4 中可以看出，W/O/W 双重保鲜乳液处理的西兰花菌落总数显著低于其他2 个处理组（P＜0.05）。表明双重乳液的缓释效果能够有效抑制西兰花中微生物的生长。裴志胜等[15]利用罗望子胶与阿拉伯胶包埋高良姜精油制备微胶囊，以用于金鲳鱼鱼糜的保鲜，结果有效降低了菌落总数；本研究结果与此一致。

2.5 W/O/W 双重保鲜乳液对西兰花在贮藏中维生素C 含量变化的影响

维生素C是西兰花中重要的营养成分。图5表明，W/O/W 双重保鲜乳液和肉桂精油/芸苔素内酯乳液均可以在一定程度上延缓西兰花中维生素C含量的降低，对其起到保护作用。这可能是由于肉桂精油中的肉桂醛具有还原性，可以在一定程度上防止维生素C被氧化，其中W/O/W双重保鲜乳液效果较好，该结果与壳聚糖精油复合涂膜对鲜切山药的保鲜效果类似[16]。

2.6 W/O/W 双重保鲜乳液对西兰花在贮藏中硫代葡萄糖苷含量变化的影响

图2 在25 ℃贮藏过程中西兰花叶绿素含量、叶绿素酶和脱镁螯合酶活性的变化Fig.2 Changes of chlorophyll content,chlorophyllase and MDCase activities of broccoli during storage at 25 ℃

图3 在25 ℃贮藏过程中西兰花总酚、总黄酮含量及DPPH自由基清除活性的变化Fig.3 Changes of total phenol,total flavonoid contents and DPPH radical scavenging rate of broccoli during storage at 25 ℃

图4 在25 ℃贮藏过程中西兰花菌落总数的变化Fig.4 Changes of total colony counts of broccoli during storage at 25 ℃

硫代葡萄糖苷是一种具有抗肿瘤功效的植物化学物质，其含量的减少意味着西兰花品质的降低。从图6 中可以看出：贮藏初期西兰花中硫代葡萄糖苷含量为21.29 μmol/g，贮藏过程中样品的硫代葡萄糖苷含量持续下降；从第2 天开始，W/O/W 双重保鲜乳液组可显著减缓其下降速度（P＜0.05）；到贮藏第5天时，对照组和肉桂精油/芸苔素内酯乳液组样品的硫代葡萄糖苷已下降至1.68 μmol/g，而W/O/W双重乳液组含量为3.14 μmol/g。

图5 在25 ℃贮藏过程中西兰花维生素C含量的变化Fig.5 Changes of vitamin C content of broccoli during storage at 25 ℃

3 讨论与结论

西兰花所含营养成分丰富，但货架期短，易褐变发霉，降低食用品质和营养价值。常规的涂膜保鲜一般是将乙醇、杀菌剂等稀释后直接涂布在西兰花表面，但由于一些有效物质易挥发或在常温下不稳定，导致涂膜物质挥发，保鲜效果的维持时间较短。本研究以西兰花为试验对象，探究双重乳液包埋肉桂精油和芸苔素内酯对西兰花贮藏过程中质量品质变化的影响，并且阐明可能的作用机制。

图6 在25 ℃贮藏过程中西兰花硫代葡萄糖苷含量的变化Fig.6 Changes of glucosinolate content of broccoli during storage at 25 ℃

研究结果显示，W/O/W双重保鲜乳液可以显著延缓明度（L*）和黄蓝（b*）值的上升，抑制西兰花的黄化褐变。相对电导率大小可以反映西兰花抗逆性和细胞膜受损伤程度[17]，细胞膜损伤会导致细胞内电解质流出从而提高电导率。相对电导率和丙二醛是反映西兰花细胞膜结构完整性的重要指标，而膜结构的破坏也会引发酶促褐变。相比于对照组和肉桂精油/芸苔素内酯乳液组，W/O/W 双重保鲜乳液可以抑制相对电导率、丙二醛含量的上升，维持西兰花细胞膜结构的完整性，减少其损伤和氧化，也延缓了褐变的发生。

叶绿素降解导致西兰花花球褪绿变黄，是植物衰老的明显标志[18-19]。叶绿素酶和脱镁螯合酶是参与叶绿素降解途径的2 个关键酶。W/O/W 双重保鲜乳液延缓了西兰花中叶绿素含量和叶绿素酶、脱镁螯合酶活力的降低。可见，W/O/W双重保鲜乳液能更有效阻止叶绿素的分解，延缓叶绿素酶和脱镁螯合酶活性的降低，保鲜效果最好。

西兰花是具有高抗氧化活性的蔬菜，其酚类物质、黄酮类物质含量丰富。酚类物质是植物次级代谢的产物，具有抗氧化、抗癌、抗病毒、抗菌等生理活性[20-21]。W/O/W 双重保鲜乳液能够显著减缓西兰花酚类物质和黄酮类物质含量的下降，从而维持较高的抗氧化活性。维生素C 具有抗氧化、抗衰老的作用，在西兰花中含量较高。硫代葡萄糖苷可以通过人结肠微生物群中的内源性黑芥子酶或硫代葡萄糖苷酶转化为高效生物活性物质萝卜硫素[22]。研究结果显示，W/O/W 双重保鲜乳液可以延缓总酚、总黄酮、维生素C、硫代葡萄糖苷和DPPH 自由基清除率的降低，保持西兰花的抗氧化活性和营养价值。WU 等[23]研究了羧甲基壳聚糖涂层和芸苔素内酯对在41 ℃和90%～95%相对湿度下储存24 d的绿芦笋的感官品质和理化特性的综合影响，结果表明，其可以在贮藏期间维持较高的总酚、维生素C 含量和DPPH 自由基清除活性。此外，W/O/W 双重保鲜乳液还可以减少微生物的生长繁殖，保持西兰花品质。双重乳液的“两隔三室”结构可以有效缓释包埋在其中的肉桂精油和芸苔素内酯，使其在整个贮藏过程中均匀释放，发挥长效保鲜作用。

综上所述，W/O/W双重保鲜乳液能够较好地维持西兰花的品质，延长其货架期，适用于西兰花的贮藏保鲜。