运脾柔肝方对便秘型肠易激综合征大鼠胃动素、生长抑素影响的实验研究

刘梦茹 邱仁静 田耀洲

[摘要] 目的 探討运脾柔肝方对便秘型肠易激综合征（IBS-C）大鼠血清及结肠组织中胃动素（MOT）、生长抑素（SS）表达的影响。 方法 选取12只Wistar大鼠为正常组，其余60只大鼠采用冰水灌胃法建立IBS-C模型。建模成功后，将大鼠按照随机数字表法分为IBS-C模型组，莫沙必利组和中药低、中、高剂量组，每组12只。正常组和IBS-C模型组给予等容积的蒸馏水，莫沙必利组给予1.35 mg/（kg·d）混悬液灌胃，中药低、中、高剂量组分别给予12.2、24.4、48.8 g/（kg·d）药剂灌胃。采用墨汁推进实验测定肠道推进率，酶联免疫吸附测定（ELISA）法和免疫组化法测定大鼠血清和结肠组织中MOT、SS的表达水平。 结果 造模后，与正常组比较，IBS-C模型组粪便颗粒数减少（P < 0.05）。给药后，与正常组比较，IBS-C模型组粪便颗粒数减少（P < 0.05）;与IBS-C模型组比较，莫沙必利组及中药低、中、高剂量组粪便颗粒数增多（P < 0.05或P < 0.01）。造模后，与正常组比较，IBS-C模型组粪便含水量减少（P < 0.01）。给药后，与正常组比较，IBS-C模型组粪便含水量减少（P < 0.05）;与IBS-C模型组比较，中药低、中、高剂量组粪便含水量增多（P < 0.01）。与正常组比较，IBS-C模型组肠道推进率明显降低（P < 0.05）;与IBS-C模型组比较，莫沙必利组及中药低、中、高剂量组肠道推进率显著升高（P < 0.05或P < 0.01）。与正常组比较，IBS-C模型组血清MOT含量降低，血清SS含量升高（P < 0.05）;与IBS-C模型组比较，莫沙必利组和中药中、高剂量组血清MOT含量升高，血清SS含量降低（P < 0.05）。与正常组比较，IBS-C模型组结肠组织MOT的MOD值明显降低（P < 0.05），SS的MOD值明显升高（P < 0.05）;与IBS-C模型组比较，莫沙必利组和中药中、高剂量组MOT的MOD值明显升高（P < 0.05），SS的MOD值明显降低（P < 0.05）。 结论 运脾柔肝方可能是通过调控大鼠血清和结肠组织中MOT、SS的表达，从而调节胃肠道激素，并改善肠道推进率和排便。

[关键词] 运脾柔肝方;便秘型肠易激综合征;胃动素;生长抑素

[中图分类号] R-332          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）03（b）-0004-06

[Abstract] Objective To explore the effect of Yunpi Rougan Recipe on the expression of motilin （MOT） and somatostatin （SS） in serum and colon tissues of rats with constipation type irritable bowel syndrome （IBS-C）. Methods Twelve Wistar rats were selected as normal group， IBS-C model was established by ice water gavage in the other 60 rats. After the successful modeling， the rats were divided into IBS-C model group， Mosapride group and low， medium and high dose of traditional Chinese medicine group according to the random number table method， with 12 rats in each group. Normal group and IBS-C model group were given equal volume distilled water， Mosapride group was given 1.35 mg/（kg·d） suspension， low， medium and high dose of traditional Chinese medicine groups was given 12.2， 24.4， 48.8 g/（kg·d） respectively. The expression of MOT and SS in serum and colon tissue of rats were measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） and immunohistochemistry. Results After molding， compared with normal group， the number of fecal particles in IBS-C model group decreased （P < 0.05）. After administration， compared with normal group， the number of fecal particles in IBS-C model group decreased （P < 0.05）; compared with the IBS-C model group， the number of fecal particles in Mosapride group and low， medium and high dose of traditional Chinese medicine groups increased （P < 0.05 or P < 0.01）. After modeling， compared with normal group， the fecal water content of IBS-C model group decreased （P < 0.01）. After administration， compared with normal group， the fecal water content of IBS-C model group decreased （P < 0.05）; compared with IBS-C model group， the fecal water content of low， medium and high dose of traditional Chinese medicine groups increased （P < 0.01）. Compared with normal group， the intestinal propulsion rate of IBS-C model group was significantly decreased （P < 0.05）; compared with IBS-C model group， the intestinal propulsion rate of Mosapride group and low， medium and high dose of traditional Chinese medicine groups was significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with normal group， the content of serum MOT in IBS-C model group decreased， and SS increased （P < 0.05）; compared with IBS-C model group， the content of serum MOT in Mosapride group， middle and high dose of traditional Chinese medicine groups increased， and SS decreased （P < 0.05）. Compared with normal group， the MOD value of the colon tissue of IBS-C model group was significantly decreased （P < 0.05）， and the MOD value of SS was significantly increased （P < 0.05）; compared with the IBS-C model group， the MOD value of mot was significantly decreased （P < 0.05）， and the MOD value of SS was significantly decreased （P < 0.05）. Conclusion Yunpi Rougan Recipe may regulate gastrointestinal hormones to improve intestinal propulsion rate and defecation by regulating the expression of MOT and SS in rat serum and colon tissues.

[Key words] Yunpi Rougan Recipe; Constipation type irritable bowel syndrome; Motilin; Somatostatin

便秘型肠易激综合征（IBS-C）是一种功能紊乱性肠病，主要临床症状表现为排便频率减少、大便干结硬块、排便习惯改变等，常伴有反复发作的腹痛、腹胀，往往与排便相关[1]。调查显示，IBS-C女性患者多于男性，且在女性患者和20～49岁人群中IBS-C的部分症状较为显著，伴随的焦虑程度与一些胃肠道症状有关[2-3]。对比西药治疗，中药治疗更能缓解患者不适症状，且复发率较低，所以我国很多医生选用中药治疗IBS-C[4]。田耀洲教授通过多年的临床实践经验总结出以柔肝运脾为主要大法的方药——运脾柔肝方，在治療IBS-C中收到较好的临床疗效[5-6]。本实验采用运脾柔肝方干预IBS-C大鼠模型，观察其对IBS-C模型大鼠肠道动力与胃动素（MOT）、生长抑素（SS）的影响，并报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验动物

成年健康清洁级Wistar大鼠80只，雌雄各半，体重（180±20）g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司[生产许可证SCXK（沪）2018-0006，实验动物合格证号：20180006002931]，于空调下架式分笼饲养，环境度（23±3）℃，湿度（55±5）%，标准颗粒饲料喂养。本实验已通过动物伦理审核，并严格按照国家实验动物福利伦理的相关规定执行。动物伦理受理编号：AEWC-20181023-57。

1.2 实验药物

运脾柔肝方由生白术30 g，决明子、莱菔子各15 g，党参、白蒺藜、当归、白芍、黄芪、枳实、厚朴各10 g，生甘草6 g组成，药物由江苏省中西医结合医院中药房提供。枸橼酸莫沙必利片（江苏豪森药业集团有限公司，批号：181010，5 mg/片）。

1.3 实验试剂

MOT酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（E-EL-R0639c）、SS ELISA试剂盒（E-EL-R0914c），武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司;MOT抗体（ab209790）、SS抗体（ab111912），Abcam公司;苏木精染液（719054）、伊红染液（719062），珠海贝索生物技术有限公司;一次性使用真空采血管（1706009），浙江拱东医疗科技有限公司;组织固定液（1809330），江苏世泰实验器材有限公司。

1.4 造模与分组方法

将80只大鼠适应性喂养并观察大鼠精神状态及粪便质量，1周后选取72只正常者用于实验。随机选取12只作为正常组，正常饲养，不灌胃;其余60只采用冰水灌胃造模方法造模[7]，每天上午8：30予0～4℃生理盐水灌胃，2 mL/只，1次/d，共14 d。造模成功后，将60只IBS-C模型大鼠，采用随机数字表法分为IBS-C模型组，莫沙必利组，中药低、中、高剂量组，每组12只。

1.5 干预方法

根据人与动物间等效剂量换算法[8]，运脾柔肝方的给药剂量分别为：低剂量组给予12.2 g/（kg·d），中剂量组给予24.4 g/（kg·d），高剂量组给予48.8 g/（kg·d）灌胃。莫沙必利组以莫沙必利混悬液1.35 mg/（kg·d）灌胃，正常组和IBS-C模型组给予等容积的蒸馏水灌胃，每天上午8：30灌胃1次，连续灌胃2周。

1.6 观察指标与检测方法

1.6.1 一般情况  观察大鼠的一般情况，如精神状态、鼠毛、活动情况、食欲等。

1.6.2 粪便颗粒及粪便含水量测定  分别记录大鼠造模后粪便颗粒数、湿粪重量、烘干后粪便重量，给药结束后粪便颗粒数、湿粪重量、烘干后粪便重量。粪便含水量=（湿粪重量-干粪重量）/干粪重量×100%。

1.6.3 碳墨推进实验肠道推进率的测定  大鼠禁食24 h，不禁水，用灌胃针灌活性炭末混悬液灌胃，3 mL/只，30 min后，以10%水合氯醛经腹腔注射进行麻醉。打开腹腔，取出完整肠道，在无牵拉状态下将肠平铺在具有对比度的洁净桌面上，测量所需数据，计算肠道推进率，碳墨推进率（%）=幽门口至碳墨前沿距离/幽门口至直肠末端距离×100%。

1.6.4 苏木精-伊红染色（HE染色）观察大鼠结肠组织病理学  取大鼠距直肠末端约6 cm处的结肠组织一块，大小0.5 cm×0.5 cm，生理盐水冲洗干净后，放入组织固定液中。将结肠组织从组织固定液内取出，进行脱水、石蜡包埋，石蜡标本连续切片，切片厚度约2 μm，采用HE染色后，应用光学显微镜，每张片子随机取5个视野进行观察并拍摄，观察大鼠结肠组织的结构和形态特征。

1.6.5 血清MOT、SS的测定  给药结束，禁食24 h后，用10%水合氯醛（3 mL/kg）注射大鼠腹腔，麻醉后，暴露腹腔，取腹主动脉血3 mL于抗凝管中，3500 r/min（离心半径10 cm）离心15 min，取上清液分别装入注有标记的离心管内，-80℃冻存备用。将储存在-80℃的大鼠血清取出，室温解冻，按照MOT、SS ELISA试剂盒步骤说明书进行操作，绘制标准曲线，计算各组大鼠血清中MOT、SS的表达水平。

1.6.6 结肠组织MOT、SS的测定  将结肠组织从组织固定液中取出后，进行脱水，石蜡包埋，切片。用免疫组化法进行结肠组织MOT、SS含量的测定，具体操作严格按照免疫组化说明书步骤进行。应用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析系统，计算阳性表达的平均吸光度（MOD，MOD=IOD/Area）。

1.7 统计学方法

采用统计软件SPSS 22.0进行统计分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较

正常组和给药组大鼠的精神状态良好，行为较为活跃，毛发整齐色泽佳，进食量多，粪便较多，质软;IBS-C模型组大鼠毛色偏黄且欠光泽，倦怠喜卧，进食量较少，粪便颗粒数较少，质地坚硬，便秘症状显著。

2.2 各组大鼠粪便颗粒数及粪便含水量比较

造模后，与正常组比较，IBS-C模型组粪便颗粒数减少（P < 0.05）。给药后，与正常组比较，IBS-C模型组粪便颗粒数减少（P < 0.05）;与IBS-C模型组比较，莫沙必利组及中药低、中、高剂量组粪便颗粒数增多（P < 0.05或P < 0.01）。见表1。造模后，与正常组比较，IBS-C模型组粪便含水量减少（P < 0.01）。给药后，与正常组比较，IBS-C模型组粪便含水量减少（P < 0.05）;与IBS-C模型组比较，中药低、中、高剂量组粪便含水量增多（P < 0.01）。见表2。

2.3 各组大鼠肠道推进率比较

与正常组比较，IBS-C模型组肠道推进率明显降低（P < 0.05）;与IBS-C模型组比较，莫沙必利组及中药低、中、高剂量组肠道推进率显著升高（P < 0.05或P < 0.01）。见表3。

2.4 各组大鼠结肠组织病理学结果

IBS-C模型组和中药低剂量组黏膜病理显示肌层断裂明显，莫沙必利组和中药中、高剂量组结肠组织结构完整，黏膜层腺体规则排列，无明显病理性改变，未见明显炎症细胞浸润，与正常组接近。见图1。

2.5 各组大鼠血清MOT和SS含量比较

与正常组比较，IBS-C模型组血清MOT含量降低，血清SS含量升高（P < 0.05）;與IBS-C模型组比较，莫沙必利组和中药中、高剂量组血清MOT含量升高，血清SS含量降低（P < 0.05）。见表4。

2.6 各组大鼠结肠组织MOT和SS免疫组化结果

显微镜下，结肠MOT蛋白表达主要分布在黏膜层，呈现褐色颗粒为阳性表达。与正常组比较，IBS-C模型组结肠组织MOT阳性颗粒数明显减少，密度较低;与IBS-C模型组比较，给药组MOT阳性表达颗粒增多，其中莫沙必利组和中药中、高剂量组MOT表达颗粒数明显增多，密度较高，着色较深，中药低剂量组阳性颗粒表达较少，密度较低，与IBS-C模型组较为接近。见图2（封四）。结肠SS蛋白表达主要分布于黏膜层，阳性表达为褐色颗粒。与正常组比较，IBS-C模型组SS阳性颗粒数明显增多，密度较高，着色较深;与IBS-C模型组比较，给药组SS阳性表达颗粒均减少，密度降低，其中莫沙必利组最为显著，中药高剂量组次之。见图3（封四）。与正常组比较，IBS-C模型组结肠组织MOT的MOD值明显降低（P < 0.05），SS的MOD值明显升高（P < 0.05）;与IBS-C模型组比较，莫沙必利组和中药中、高剂量组MOT的MOD值明显升高（P < 0.05），SS的MOD值明显降低（P < 0.05）。见表5。

3 讨论

《肠易激综合征中医诊疗专家共识意见2017》[9]指出IBS-C主要病机为脾胃虚弱和/或肝失疏泄，肝郁脾虚是导致IBS发生的重要病机。田耀洲教授多年来在临床实践中总结出IBS-C的主要病机为肝脾不和，对IBS-C的治疗与《肠易激综合征中医诊疗专家共识意见2017》[9]不谋而合。田教授认为本病以脾虚为本，肝郁为标，肝与脾胃同居中焦，共同影响中焦气机的升降出入;肝郁不畅，乘侮脾土，则脾胃升降失司，大肠传化功能失常，留滞肠道，以致便秘。若肝木得之疏泄，脾胃得以补养，则气机方可升降畅达，故以健脾柔肝、理气通便为治疗大法创建运脾柔肝方。方中以生白术、白蒺藜为君药，润肠通便，疏肝解郁;党参、黄芪、白芍、当归共为臣药，益气健脾，缓急止痛，润肠通便;枳实、厚朴、莱菔子、决明子为佐药，破气消积导滞，下气消食，润肠通便;甘草为使药，缓急止痛，调和诸药。现代药理及实验研究表明，大量生白术可以修复Cajal间质细胞，促进肠道收缩和蠕动[10];大量生白术与枳实配伍能上调5-HT3R、5-HT4R的表达而促进肠道动力[11];当归可改善结肠黏膜萎缩，增加结肠黏液分泌，具有软化粪便、促进粪便排出的作用[12];决明子能够刺激肠黏膜改善结肠运动功能，减少结肠内水分的吸收[13];黄芪多糖具有肠保护的作用[14];党参和莱菔子提取物具有增加排便次数、缩短排便时间、促进肠道推进的作用[15-16]。

IBS-C的病因繁多，发病机制尚未完全阐明。目前普遍认为其发病可能与胃肠运动功能紊乱、微生物群的改变、内脏高敏感性、炎症等有关[17-19]。而在调节胃肠道运动功能中胃肠激素也发挥着重要作用。本实验发现，造模后，正常组与其他各组粪便颗粒数、粪便含水量比较均有显著性差异，IBS-C模型组肠道推进率与正常组也具有显著性差异，提示本实验成功复制了IBS-C大鼠模型。运脾柔肝方干预后，大鼠排便质量得到改善，粪便颗粒数和粪便含水量显著升高，肠道推进率明显改善，提示运脾柔肝方可改善大鼠的肠道动力。MOT在胃肠黏膜中的主要生理功能是增加消化道的收缩和蠕动，促进胃蛋白酶的分泌。研究发现，MOT的含量高低影响患者的症状表现，MOT含量升高，表现为腹泻;含量降低，则表现为便秘[20]。MOT表达水平升高可刺激胃肠道进行机械运动，还可影响SS的释放[21]。人体内的大部分SS存在于消化道，位于肠道和胰腺，约占75%[22-23]。SS具有抑制肠道蠕动、减少肠液和一些多肽类激素分泌、降低肠道血流量的作用。本实验结果中显示，相比IBS-C模型组，莫沙必利组和中药组MOT表达升高，SS表达降低，其中莫沙必利组与中药高剂量组MOT、SS表达水平相当。然而在症状的改善上，中药高剂量组优于莫沙必利组，其机制还需进一步探究。

综上所述，MOT、SS与IBS-C的发生和发展有着重要联系，运脾柔肝方对于改善IBS-C症状疗效确切。其作用机制之一可能是增强MOT表达并抑制SS表达，调节机体内胃肠激素水平，从而改善排便和促进肠道蠕动，改善IBS-C症状，对于其他作用机制仍需进一步研究。

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（收稿日期：2019-10-23  本文编辑：李亚聪）