基于TCGA数据库及转录组数据分析HDAC1基因在胃癌中的表达和临床意义*

李抄，陈定宇，张晓怡，赵艳，王琴容，周建奖，鲍丽雅，谢渊**

(1.贵州医科大学 地方病与少数民族性疾病教育部重点实验室，贵州省医学分子生物学重点实验室，贵州医科大学 分子生物学重点实验室，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附院 感染科 肝炎实验室，贵州 贵阳 550004)

胃癌(gastric cancer,GC)是全球发病率第4位的恶性肿瘤，在肿瘤中致死率居第2位，是最常见的癌症类型之一[1]。GC的传统治疗方法有胃切除术和放化疗，但其复发率和死亡率很高，5年总生存率(overall survival，OS) 低于25%[2-3]。GC的发生发展是一个多阶段多因素参与的过程，幽门螺杆菌(helicobacterpylori,H.pylori)毒力因子、众多的细胞因子及信号通路在其中扮演重要角色[4]，因此，寻找与GC早期诊断、治疗和预后密切相关的新靶点一直是近年来研究的热点。细胞毒素相关基因A蛋白(cytotoxin associated gene A,CagA)是H.pylori的主要毒力因子，是已知的唯一注入胃上皮细胞的癌蛋白，可引起正常细胞分化的修饰，改变细胞极性和细胞黏附，与炎症反应增加、消化性溃疡和GC发生的风险有关[5-7]。本课题组前期用CagA转染胃上皮细胞转录组分析发现，cagA基因可引起组蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1，HDAC1)表达增高。有研究发现HDAC1在人GC细胞中高表达，且与预后相关[8]；组蛋白乙酰化/去乙酰化调控是表观遗传学中研究的主要内容，HDAC1催化组蛋白去乙酰化反应，下调组蛋白乙酰化水平，可使染色质被压缩成致密构象，转录活性下降[9]；组蛋白乙酰化/去乙酰化水平的失衡或其调节酶的异常与GC发生、发展存在密切的联系[10]。这些研究提示HDAC1可能作为GC临床预后评估的指标以及靶向治疗的新靶点。因此，本研究通过对癌症基因组图谱(the cancer genome atlas，TCGA)公共数据库，分析HDAC1 mRNA在GC组织和正常胃组织中的表达差异，分析GC中HDAC1表达水平量与临床病理特征参数的相关性，预测HDAC1可能的相关信号通路及参与的功能富集，为GC发生发展的作用机制提供研究线索。

1 资料与方法

1.1 资料

从TCGA数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)中下载并预处理GC数据集中444例标本的HDAC1 mRNA表达RNASeqV2数据，其中正常胃组织且HDAC1 mRNA表达量正常样本36例作为正常组，408例GC组织样本中再筛选出性别、年龄、瘤体大小(T1、T2、T3、T4) 、淋巴结转移(N0、N1、Nx) 、远处转移(M0、M1、Mx)及美国癌症联合会(American Joint Committe on cancer ，AJCC)病理特征分期完整的371例作为GC组。GC组男239、女132例，年龄≤60岁122例、>60岁249例，T1+T2期53例、T3+T4期318例，N0期113例、N1期112例及Nx期146例，M0期326例、M1期24例及Mx期21例，Stage I+Stage II 51例、Stage III+Stage IV 320例；正常组男23例、女13例，年龄≤60岁7例、>60岁122例。此外，按GC组患者HDAC1 mRNA表达量均值大小将GC组分为高表达组(高于均值)271例和低表达组(低于均值)100例，一般资料见表1。

1.2 方法

1.2.1HDAC1相关基因筛选 登录LinkedOmics数据库(http://www.linkedomics.org/)首页，选择肿瘤类型为“GC”，靶点为“HDAC1”，数据集选择TCGA数据集，分析与HDAC1表达相关的基因。

1.2.2基因功能富集分析(Omicsbean-Canner) 利用 Omicsbean-Canner V1.0网站(http://www.omicsbean.cn/)按照网站操作步骤对HDAC1基因进行GO Enrichment分析，包括Molecular Function、Biological Process及Cell Component 富集结果等，进一步结合既往对GC研究的靶点基因，选取有意义的信号通路。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 HDAC1基因表达量

GC组标本HDAC1基因平均表达量(5.29±0.55)，明显高于正常组(4.59±0.63)，差异有高度统计学意义(t=6.88，P<0.01)，见图1。

注：(1)与正常组比较，P<0.01。图1 GC组与正常组被检者HDAC1基因表达Fig.1 HDAC1 differential expression in GC and normal subjects

2.2 GC组HDAC1 mRNA基因表达与临床病理参数的关系

HDAC1 mRNA基因高、低表达组GC患者间的临床病理参数比较结果显示，HDAC1 mRNA基因的表达高低与患者的年龄、T分期、AJCC分期及幽门螺杆菌(H.pylori)感染等病理参数呈正相关性(P<0.05)，但与性别、N分期及M分期等病理参数无相关性(P>0.05)。见表1。

表1 GC患者HDAC1 mRNA基因表达水平与临床病理参数的关系Tab.1 Correlation of HDAC1 mRNA gene expression level and clinicopathological parameters in patients with GC

2.3 GC组HADC1 mRNA表达与预后

对TCGA数据集中GC患者的预后进行Kaplan-Meier分析，绘制生存函数曲线，结果表明，HDAC1 mRNA高、低表达与GC患者生存无相关性(P>0.05)，见图2。

图2 HDAC1高、低表达组GC患者预后的Kaplan-Meier分析Fig.2 Kaplan-Meier analysis of overall survival in GC patients with HDAC1-high and -low expression groups

2.4 GC组HADC1相关基因分析

使用LinkedOmics数据库对GC组HADC1进行相关基因分析，以P<0.05为界限，共检索到HADC1基因表达与AK2(adenylate kinase 2)、EIF3I(eukaryotic translation initiation factor 3 subunit I)及MARCKSL1(MARCKS like 1)等9 118个基因表达量呈正相关，与GNAL(G protein subunit alpha L)、ARMCX2(armadillo repeat containing X-linked 2)及CCDC46(centrosomal protein 112)等10 907个基因表达量呈负相关，见图3。

2.5 HDAC1的功能基因富集分析

Omicsbean-Canner功能富集分析结果表明，HDAC1基因功能显著富集到细胞周期、notch信号通路及Transcriptional misregulation in cancer等，见图4。

3 讨论

GC作为一种高发恶性肿瘤，给人民群众的健康带来了巨大的威胁，也给社会带来了沉重的负担[11]。虽然GC的诊断和治疗技术有了持续进展，但GC的发病机制仍未完全阐明[12]。因此，寻找新的靶点对于GC的诊断和治疗有着重要的意义。TCGA组学数据库有着样本量大、数据信息丰富完整及随访时间长等优点；因此得到的结论较为可靠，有利于充分认识基因在肿瘤发生发展中的作用[13-14]。通过生物医学大数据分析，可以为进一步研究基因在肿瘤的功能和调控机制奠定基础。

注：A 为HDAC1关联结果，B为正相关基因，C为负相关基因。图3 HADC1相关基因分析Fig.3 HADC1-related gene analysis

图4 HADC1基因的功能富集Fig.4 The functional enrichment of HADC1 gene

乙酰化作用在真核细胞的转录调控中起核心作用。在细胞核内，组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化过程处于动态平衡；并由组蛋白乙酰化转移酶(histone acetyltransferase,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)共同调控[15]。HAT将乙酰辅酶A的乙酰基转移到组蛋白氨基末端特定的赖氨酸残基上，HDAC使组蛋白去乙酰化，与带负电荷的DNA紧密结合，染色质致密卷曲，基因的转录受到抑制[16]；HDAC还参与调节组蛋白乙酰化水平，组蛋白乙酰化也可能作为一种信号，传达信息改变相邻核小体上组蛋白之间的功能状态，影响组蛋白与转录因子间的作用，HDAC与HTA共同作用维持细胞内乙酰化与去乙酰化的平衡状态，如这一平衡被打破可能导致疾病发生[17-18]；HDAC抑制剂已被应用于临床治疗恶性肿瘤，有越来越多的研究证实HDAC抑制剂能够诱导不同的肿瘤细胞增殖停滞、细胞分化、凋亡等。

本研究发现，GC组标本HDAC1基因平均表达量明显高于正常组，差异有高度统计学意义(P<0.01)，提示HDAC1可能是GC中的一个重要的促癌基因；进一步分析HDAC1与GC患者临床特征的关系，结果显示HDAC1基因的表达水平与患者的年龄、T分期、AJCC分期及H.pylori感染呈正相关(P<0.05)，但与性别、N分期及M分期无相关(P>0.05)，以上结果表明HDAC1基因高表达可能是GC的预后一种不利因素。为了进一步探索HDAC1在GC中可能的作用机制，本研究通过LinkedOmics数据库分析HDAC1密切相关的基因，结果显示HDAC1表达与AK2、EIF3I及MARCKSL1显著正相关，与GNAL、ARMCX2及CCDC46 显著负相关，EIF3I的体外过表达导致细胞大小增加，增殖增强，细胞周期进程和锚定非依赖性生长，EIF3I过表达促进mTOR(mechanistic target of rapamycin)将生长信号整合到mRNA翻译过程中，从而促进蛋白质合成和肿瘤生长[19-20]，MARCKSL1在细胞凋亡的调节中起着关键作用，并已显示出维持抗肿瘤和转移抑制的特性[21-22]，以上可能为HDAC1潜在的上下游分子。在Omicsbean-Canner中以HDAC1基因目标显著富集到细胞周期、notch信号通路、Transcriptional misregulation in cancer等信号通路及功能。有研究发现Notchl信号通路过表达可能参与胃黏膜的癌变过程，而且Notchl的表达与GC恶性程度负相关,表明Notch信号通路在GC组织中的双重效应[23-26]，推测CagA可能通过HDAC1高表达途径来调控细胞周期及Notch信号通路等来促进GC的进展。

综上所述，本研究通过对TCGA数据库基因芯片数据库的数据挖掘，可知HDAC1基因在GC中呈高表达，并与GC患者的年龄、T分期、AJCC分期及H.pylori感染显著相关，与预后无相关。然而本研究也存在一些不足，比如TCGA数据库中为RNASeq数据，可能无法完全代表HDAC1蛋白表达水平以及研究数据部分分组样本量较少可能造成统计学偏差，提示后续研究可通过Western blot和免疫组织化学技术从蛋白质表达水平验证HDAC1分子机制与信号通路，为探明GC的发生发展和靶向治疗提供新的思路。