消痛灵喷雾剂的工艺优化及对小鼠的抗炎镇痛作用*

梁语嫣，彭梅，杨小生1,，陈发菊，罗忠圣，杨礼寿，邓廷飞，王丽，王道平，杨娟1,***

(1．贵州医科大学 药学院，贵州 贵阳 550025;2.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州 贵阳 550014)

消痛灵喷雾是本课题组研发的一种治疗跌打损伤的中药复方制剂，由透骨香、防风等几味药材组成，透骨香在配方中作为君药。透骨香Gaultheriayunnanensis(Franch.)Rehd 为杜鹃花科植物滇白珠全草或根[1]，有抑菌、抗氧化、活血通络[2]、顺气平喘[3]的功效，被我国少数民族广泛用于治疗风湿性关节炎[4-5]。现代药理学研究显示，透骨香中的水杨酸具有消炎镇痛、杀菌等多重药效作用，长期以来一直作为临床药物被广泛使用[6-7]，因此，在制备消痛灵工艺条件中，以配方中的水杨酸含量作为考察指标。课题组的前期研究基础表明，消痛灵喷雾剂的配方中主要含挥发油等成分，喷雾剂中的挥发性成分对小鼠跌打损伤也具有比较显著的治疗作用。因此为了保证消痛灵喷雾剂临床疗效的稳定性和连续性，本研究在不破坏配方的挥发性成分的基础上，沿用民间外敷或榨汁擦抹的方法，在制备工艺中采用乙醇为提取溶剂、冷浸法进行提取，以透骨香中水杨酸为指标，选择4个因素运用L9(43)正交实验，选出最佳制备工艺；并采用最佳工艺制备消痛灵喷雾，观察该喷雾剂对二甲苯致小鼠耳肿胀、蛋清所致小鼠足肿胀及醋酸致小鼠扭体的影响，为药物的进一步开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 昆明种小鼠，体质量(20±2)g，雌雄各半，中国人民解放军第三军医大学实验动物中心提供。合格证号SCXK-(军)2012-0011。

1.1.2药物 透骨香、防风等4种药材(购买于贵州贵阳市万东桥中药材市场)，贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为正品。云南白药气雾剂(国字标准Z53021107)。

1.1.3试剂及仪器 冰醋酸(成都市科龙化工试剂厂)，食用乙醇、二甲苯(天津富宇精细化工公司)，水杨酸(中国食品药品检定研究院，批号NIC-100106)，甲醇(色谱纯，上海星可高纯溶剂有限公司)，UV-1800型紫外分光光度计(日本岛津公司)，1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)，JA2003精密电子天平(上海浦春剂量仪器有限公司)，YLS-Q4型鼠耳打孔器(北京吉安得尔科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1正交试验设计[8-9]通过预实验确定水杨酸提取主要影响因素为乙醇浓度、料液比、渗漉时间及粉碎度，从而选取浸泡天数(A)、乙醇浓度(B)、料液比(C)、粉碎度(D)作为考察因素，设计3个水平，以水杨酸的含量为指标，设计L9(43)正交实验，见表1。

表1 消痛灵喷雾剂L9(43)正交试验设计表Tab.1 Orthogonal test design of Xiaotongling spray L9 (43)

注：A为浸泡天数，B为乙醇浓度，C料液比为，D为粉粒度。

1.2.2水杨酸含量测定[10-11]色谱柱为Gemini-Nx色谱柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，流动相为甲醇-水(甲醇与水为35 ∶65)，检测波长306 nm，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，进样量为5.0 μL，理论板数按水杨酸计应不低于3 000 。

1.2.3制备试药 将透骨香、防风等4味药材按本课题组前期研究的药材比例称取共50.00 g，置于1 000 mL锥形瓶中，按工艺优选后的乙醇浓度、料液比、浸泡时间，粉碎粒，依照冷浸法，过滤，稀释为乙醇浓度40%，待用。消痛灵喷雾剂以优选出最佳工艺制备作为高剂量(以含生药材量计0.16 g/L)。

1.2.4二甲苯致小鼠耳肿胀实验 50只小鼠随机均分为对照组(生理盐水)、阳性组(云南白药喷雾剂)、消痛灵喷雾剂高、中、低剂量组(0.16、0.08及0.04 g/L)，将相应药物涂于小鼠耳部与腹部，3次/d，连续5 d。第5天各组小鼠右耳两面均匀涂抹相应药物1 次，给药30 min 后，各组小鼠右耳两面均匀涂抹二甲苯30 μL，2 h后麻醉状态下处死小鼠，剪下左右耳，用直径8 mm 打孔器打下同一部位耳片，称取质量，计算肿胀率及抑制率[12-14]。

1.2.5对小鼠蛋清所致足肿胀的影响[15-17]分组及给药时间同“1.2.4”，将各组相应药物涂于小鼠足部与腹部。末次给药前以螺旋测微仪测量右后足跖厚度，作为致炎前右后足正常厚度，在末次给药30 min 后，取10%(v/v)鸡蛋清生理盐水溶液0.1 mL于小鼠右后足跖中部皮下注射致炎并标记，并记录注完时间。分别测量各组小鼠致炎前后0.5、1及2 h右后足跖厚度，减去致炎前足跖厚度，计算足肿胀。

1.2.6醋酸扭体实验[18-20]分组及给药时间同“1.2.4”，各组小鼠腹部去毛，暴露2 cm×2 cm的皮肤为给药区。末次给药30 min后，每只小鼠腹腔注射1%冰醋酸0.2 mL，记录注射后15 min 内小鼠扭体次数。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 正交试验及方差分析

以表2中的极值R进行分析，各指标因素影响的主次顺序是A>B>C>D，根据K值进行比较可得，A因素中K3值最大，B因素中K2值最大，C因素中K2值最大，D因素中K1值最大。表3中，将离差平方和中最小的项近似作为误差的估计，用来计算各因子列的F比值，可以看出A因素的3个水平存在较大差异，对实验的结果影响较大，B、C和D因素的3个水平对实验结果影响较小，结合表3方差分析可以得出最佳提取工艺为A3B2C2D1，即最佳方案：浸泡时间为7 d、浓度为75%乙醇、液料比为 1 ∶5，药材过10目筛大小，使用时将配置出的配方稀释至含乙醇浓度为40%即可。

2.2 消痛灵喷雾对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响

结果显示，不同剂量组治疗后的肿胀抑制率存在差异，各治疗组均有抑制作用，其中中剂量组显著抑制二甲苯所致耳廓肿胀，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，且肿胀率、抑制率接近阳性组。见表4。

表2 消痛灵喷雾剂L9(43)正交试验结果Tab.2 Orthogonal test results of xiaotongling spray L9 (43)

注：A为浸泡天数，B为乙醇浓度，C料液比为，D为粉粒度，R为同列Ki的极值。

表3 消痛灵喷雾剂制备工艺方差分析表Tab.3 Variance analysis table of preparation process of xiaotongling spray

注：A为浸泡天数，B为乙醇浓度，C料液比为，D为粉粒度。

表4 消痛灵喷雾剂对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响Tab.4 Effects of xiaotongling spray for xylene-induced ear swelling in mice

注：“-”为不做计算，(1)与对照组比较，P<0.05。

2.3 消痛灵喷雾对蛋清致小鼠足肿胀影响

结果显示，与对照组比较，消痛灵喷雾剂高、中剂量组给药30 min及给药90 min，高剂量组给药60 min，小鼠足趾肿胀度均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 消痛灵喷雾剂对蛋清致小鼠足跖肿胀的影响Tab.5 Effects of xiaotongling spray for egg white-induced paw swelling in

注：(1)与对照组比较，P<0.05。

2.4 消痛灵喷雾对醋酸所致小鼠疼痛的影响

结果显示，与对照组比较，各治疗组均能在一定程度上抑制醋酸所致的疼痛反应，注射后15 min内小鼠扭体次数减少，但与空白对照组比较，仅高剂量组小鼠扭体次数显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)，表明消痛灵喷雾剂对醋酸引起的疼痛有显著的抑制作用。见表6。

表6 消痛灵喷雾剂对醋酸致小鼠疼痛的影响Tab.6 Effects of xiaotongling spray one pain

注：(1)与对照组比较，P<0.05。

3 讨论

炎症是人类疾病中最广泛、最常见的病理过程，是具有血管系统的活体组织对局部损伤的反应。许多研究证明，炎症的发生往往伴随着疼痛反应，并相互影响。本研究中的消痛灵喷雾剂为透骨香，防风等几味药材组成的复方制剂，其中透骨香中的水杨酸作为一种具有广泛活性的化合物，与阿司匹林的结构母核一致，具有相应非甾体抗炎类药物的药效特征，很早就已被中国、日本及美国等多个国家药典收录[21-22]，因此选作消痛灵喷雾剂工艺优化的考察指标。考虑到组方药材中含有挥发性物质，因此采用冷浸法对其制备，以减少有效物质损失[23]。课题组的前期研究基础表明，消痛灵喷雾剂的配方中主要含挥发油等成分，喷雾剂中的挥发性成分对小鼠跌打损伤也具有比较显著的治疗作用。因此为了保证消痛灵喷雾剂临床疗效的稳定性和连续性，以及进一步对消痛灵喷雾剂药效学研究提供数据参考。本研究在不破坏配方的挥发性成分的基础上，沿用民间外敷或榨汁擦抹的方法，制备工艺中采用乙醇为提取溶剂，冷浸法进行提取，以透骨香中水杨酸为指标，选择4个因素运用L9(43)正交实验，筛选其最佳制备工艺，得出消痛灵喷雾剂的最佳提取工艺为A3B2C2D1，即最佳方案为浸泡时间为7 d、浓度为75%乙醇、液料比为1 ∶5，药材过10目筛大小，使用时将配置出的配方稀释至含乙醇浓度为40%即可。

为了研究最优工艺条件制备的消痛灵喷雾对小鼠消炎及镇痛效果，本研究选用的2种炎症动物模型(小鼠足肿胀及小鼠耳肿胀)，属于急性炎症模型，可引起组胺、5羟色胺(5-HT)等炎症介质的释放，导致局部毛细血管通透性亢进、渗出和水肿，红、肿、热、痛等早期急性炎症表现[24-25]。实验结果表明，与空白组比较，消痛灵喷雾剂中剂量组显著抑制二甲苯致小鼠耳肿胀，同时，高、中剂量组从致炎30 min开始可明显抑制足肿胀可持续到90 min，表明消痛灵喷雾剂具有较强抗炎作用。在镇痛实验中，高剂量组能明显减少醋酸致小鼠能扭体次数，且其抑制率与阳性对照组相当。

综上所述，消痛灵喷雾剂的制备工艺为，浸泡时间7 d、75%浓度乙醇、液料比为 1 ∶5、药材过10目筛大小，在最佳工艺条件下制备的消痛灵喷雾剂具有较好的抗炎镇痛效果，为该产品的进一步开发提供了实验依据。