蒜头果蛋白的纯化鉴定及分析

杨 敏

(1.云南农业大学 香料研究所，昆明 650201； 2.云南大学 教育部自然资源药物化学重点实验室，昆明 650091)

蒜头果(MalaniaoleiferaChun et S. Lee)又名马兰后、咪民、猴子果、山桐果等[1]，常绿乔木，属铁青树科(Olacaceae)蒜头果属，是我国特有单种属稀有植物。蒜头果是国家二级保护树种，广西重点保护野生植物，仅分布于广西西部和云南东南部的狭窄地带，生长于石灰岩的山坡、山脚杂木林中土壤湿润肥沃的地方。国外无蒜头果资源也未见有关蒜头果的研究报道，国内植物学家对蒜头果研究的历史也很短，直到1980年，广西植物研究所的李树刚教授才正式发表蒜头果的拉丁名为Malaniaoleifera，并将其置于铁青树科。蒜头果种仁富含油脂，含油率高达51.85%～67.0%，油中脂肪酸主要为油酸、棕榈酸和硬脂酸等，为良好的木本油料[2]。蒜头果油中含有二十四碳-15-烯酸，其是一种长链单不饱和脂肪酸，具有活跃脑细胞，治疗身体免疫缺乏性疾病、心血管疾病等功用，是合成麝香酮的理想原料[2]。目前有关蒜头果的研究并不多，且主要侧重在种质资源调查[3]、育苗技术[4]、营林、濒危机制[5]、所含油脂的利用等方面[6]，对蒜头果蛋白的研究鲜有报道。

本文以蒜头果种仁为原料，通过粉碎、抽提、硫酸铵沉淀、疏水色谱层析等分离手段，分离纯化出蒜头果蛋白，分析测定了其相对分子质量、氨基酸组成、等电点、中性糖含量等基本理化指标及细胞活性，为蒜头果蛋白作为新药的研发奠定基础，为蒜头果资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

蒜头果种仁，购自云南文山。Hiprep 16/10 Phenyl FF(High Sub,20 mL)层析柱,Amersham公司；考马斯亮蓝G-250；β-巯基乙醇，Amresco公司；其余试剂均为国产分析纯。

Amersham AKTA explorer 100蛋白纯化系统，Amersham Hoefer SE260蛋白质电泳系统，HITACHI CR21G高速冷冻离心机，CHRIST ALPHA1-4真空冷冻干燥机，Amersham小型湿法电转仪，Molecular Devices Corporation Spectra Max190超级酶标仪。

1.2 实验方法

1.2.1 蒜头果蛋白的提取、纯化

将蒜头果种仁捣碎，加入pH 7.2的磷酸盐缓冲液中4℃浸提过夜，纱布过滤，离心去除不溶物，上清液加入30%～80%硫酸铵梯度沉淀。用少量去离子水溶解沉淀，离心，收集沉淀充分透析，真空冷冻干燥得粗蛋白干粉。用20 mmol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液(内含25 mol/L(NH4)2SO4)平衡疏水预装柱Hiprep 16/10 Phenyl FF(High Sub)后，沉淀用20 mmol/L pH 7.2的磷酸盐缓冲液溶解后进样，用去离子水按0%～100%线性梯度洗脱，流速为4 mL/min，按峰高用分部收集器收集目标蛋白(malanin)。

1.2.2 纯度鉴定

SDS-PAGE检测产物纯度：分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为3%，考马斯亮蓝G-250染色[7]。蒜头果蛋白取样量为20 μL，在处理蒜头果蛋白样品时，为了验证蒜头果蛋白中的二硫键，分别在上样缓冲液中一个加入5 μLβ-巯基乙醇，另一个则不加β-巯基乙醇，在相同条件下各煮沸5 min变性后，再进行SDS-PAGE以进行比较。

1.2.3 相对分子质量的测定

样品送至上海中科新生命生物科技有限公司采用基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定。

1.2.4 氨基酸含量的测定

用6 mol/L盐酸将蒜头果蛋白回流煮沸24 h左右，使之水解成游离的氨基酸，采用氨基酸自动分析仪分析各氨基酸的含量。

采用碱水解-荧光分光光度法测定色氨酸含量。在蛋白质的氢氧化钠水解液中，能检测到色氨酸和酪氨酸的荧光。在pH为11时，色氨酸的荧光强度比酪氨酸的大100倍，且两种氨基酸的荧光峰相差40 nm，因此在有大量酪氨酸存在的情况下可用荧光分光光度法测定色氨酸含量。实验方法按文献[8]进行，在荧光分光光度计上，测定蒜头果蛋白氢氧化钠水解液的荧光强度。根据色氨酸标准溶液的荧光强度曲线，计算蒜头果蛋白色氨酸含量。

1.2.5 等电点的测定

将蒜头果蛋白干粉样品送至上海中科新生命生物科技有限公司采用平板等点聚焦法(IEF-PAGE)测定蒜头果蛋白的等电点。

1.2.6 中性糖含量的测定

1.2.6.1 标准曲线的制作

采用硫酸苯酚法[9-11]进行中性糖含量的测定。以葡萄糖作为标准，参照袁燕等[12]的方法在波长490 nm[13]下测定不同质量浓度的葡萄糖溶液的吸光度，以葡萄糖溶液质量浓度(Y)为纵坐标，吸光度(X)为横坐标绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程：Y=0.008 07+0.031 52X(R=0.998 14)。

1.2.6.2 样品中性糖含量的测定

取已知质量浓度的蒜头果蛋白溶液250 μL于2 mL离心管中(2个平行样)，加入150 μL 6%的苯酚，涡旋混匀，再迅速滴入750 μL浓硫酸，涡旋混匀，于90℃水浴20 min。待样品冷却至室温后每个样品吸取200 μL转移至96孔酶标板于酶标仪上读取 490 nm 处的吸光度,计算中性糖含量。中性糖含量=V×w/m×100%，式中：V为样品稀释后的体积，w为由标准曲线得出的糖质量浓度，m为样品的质量。

1.2.7 蒜头果蛋白质谱鉴定

应用SDS-PAGE将蒜头果蛋白分离出蒜头果蛋白-A和蒜头果蛋白-B 2条蛋白带，从胶中切取目的蛋白条带，经脱色液脱色，二硫苏糖醇还原，碘乙酰胺烷基化，胰蛋白酶酶解，三氟乙酸萃取和用ZipTip C18柱脱盐处理，将制备好的样品与基质按1∶1 混匀后点于靶上，采用MALDI-TOF-MS分析(激光波长337 nm，加速电压20 kV,正离子模式检测，质谱信号为单次扫描累加)对蛋白质进行鉴定[14]。

1.2.8 自由巯基含量的测定

DTNB(Ellman’s reagent)可以与巯基结合，形成的复合物在412 nm处有光吸收，因而可以用此法对蛋白中的自由巯基定量。实验参照文献[15]进行。

取一块96孔酶标板，选取一块4 mm×4 mm的区域每孔加入DTNB工作液200 μL、50 μL Tris-HCl缓冲溶液(1 mol/L Tris-HCl，pH 8.0)、50 μL DTNB贮液(2 mmol/L DTNB，50 mmol/L乙酸钠)、100 μL蒸馏水，再分别加入50 μL 160 μmol/L胰蛋白酶(由PDB结构数据库查询得知胰蛋白酶不含自由巯基，可作为阴性对照)、蒜头果蛋白、BSA(由PDB结构数据库查得每分子BSA含1个自由巯基，可作为阳性对照)，空白对照加入50 μL蒸馏水，每个样品设置4个复孔，37℃放置10 min，于酶标仪上读取412 nm处的吸光度。

1.2.9 蒜头果蛋白的细胞活性测定

将Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)和Hela(人宫颈癌细胞)在含有10%灭活小牛血清的DMEM培养液内，37℃、5%CO2条件下的培养箱中培养24 h，同时将蒜头果蛋白干粉配成质量浓度分别为50、10、1、0.1 μg/mL的溶液，在无菌室的超净工作台上用一次性过滤器(0.22 μm)过滤除菌后，点样(50 μL/孔)，继续在培养箱中培养1 d后，用倒置显微镜观察结果。

2 结果与讨论

2.1 蒜头果蛋白的分离纯化

图1为280 nm下蒜头果蛋白分离纯化的疏水色谱层析图。从图1可以看出，在280 nm下吸收值最大的吸收峰即为蒜头果蛋白。另外，在蒜头果蛋白分离纯化过程中发现，硫酸铵沉淀时，最佳的硫酸铵饱和度区间是30%～50%，是蛋白集中沉淀区。

图1 蒜头果蛋白分离纯化的疏水色谱层析图

2.2 蒜头果蛋白的纯度鉴定

图2为蒜头果蛋白的SDS-PAGE图。由图2可见，非还原的蒜头果蛋白样品只有1条非常清晰的条带，说明蒜头果蛋白纯度比较高，而用β-巯基乙醇处理后还原的蒜头果蛋白则被裂解成A、B 2条带，说明蒜头果蛋白是一种双链蛋白质。

注：1.标准蛋白； 2.粗蛋白； 3.非还原的蒜头果蛋白；4.还原处理的蒜头果蛋白。

图2 蒜头果蛋白的SDS-PAGE图

2.3 蒜头果蛋白的相对分子质量

图3为蒜头果蛋白B链的质谱图。 B链的表观相对分子质量约为30 kDa(见图2)，结合图3可知，B链相对分子质量为29 444.7 Da，前面出现的两个峰分别为二价峰和三价峰。经基质辅助激光解吸飞行时间质谱测定完整的蒜头果蛋白相对分子质量为61 875 Da，因而A链相对分子质量为32 430.3 Da。

图3 蒜头果蛋白B链的质谱图

2.4 蒜头果蛋白的氨基酸含量

蒜头果蛋白的氨基酸组成测定结果见表1。由表1可见，蒜头果蛋白中含有18种氨基酸，其中天冬氨酸含量最高，蛋氨酸含量最低。

表1 蒜头果蛋白的氨基酸组成 %

2.5 蒜头果蛋白等电点

蒜头果蛋白的平板等点聚焦电泳图如图4所示。由图4可见，蒜头果蛋白的等电点约为4.6。

注：图中左边泳道为Marker，从上往下依次为pH 9.6、pH 8.2、pH 8、pH 7.8、pH 7.5、pH 7.1、pH 7、pH 6.5、pH 6、pH 5.1、pH 4.75、pH 4.5，右边泳道为蒜头果蛋白。

图4 蒜头果蛋白的平板等点聚焦电泳图

2.6 蒜头果蛋白中性糖含量

SDS-PAGE中蒜头果蛋白能被高碘酸-Schiff(PAS)染成紫红色，说明其是一种糖蛋白。实验测得蒜头果蛋白中性糖含量为6.0%，蒜头果蛋白的A链中性糖含量为10.4%，B链不含糖。

2.7 蒜头果蛋白的质谱鉴定

按照1.2.7方法，采用MALDI-TOF-MS和ESI-MS/MS分别测得A链和B链肽质量酶谱，在蛋白质Peptldent数据库中进行检索，没有发现与蒜头果蛋白相匹配的蛋白质序列，因此可以确定蒜头果蛋白为新蛋白质。

2.8 蒜头果蛋白自由巯基含量

蒜头果蛋白自由巯基含量的测定结果见表2。

表2 DTNB法测定蒜头果蛋白自由巯基的含量

由表2可知，与DTNB工作液反应后，蒜头果蛋白、胰蛋白酶溶液的A412与空白相近，而BSA溶液的A412明显高出许多。可据此得出结论：蒜头果蛋白不含自由巯基。

2.9 蒜头果蛋白细胞活性

按1.2.9方法，发现点样后培养1 d就可以观察到细胞的病变，用倒置显微镜观察，开始时有部分细胞紧缩，然后可见整片的细胞呈网状，继而细胞发生崩解。与阴性对照比较，蒜头果蛋白表现出非常强烈的细胞毒性，即使在0.1 μg/mL质量浓度下，Hela和Vero细胞2 d后全部死亡。图5、图6分别为观测的未加蒜头果蛋白、加蒜头果蛋白(0.1 μg/mL)培养的Hela细胞。

图5 未加蒜头果蛋白培养的Hela细胞

图6 加蒜头果蛋白(0.1 μg/mL)培养后的Hela细胞

有研究发现蒜头果蛋白能抑制肝癌细胞HepG-2的生长[16]，对人白血病HL-60细胞的生长具有明显的抑制作用，且呈一定的剂量和时间依赖性[17]，具有明显抑制人白血病K562细胞体外生长的作用[18]。

3 结 论

本研究采用磷酸盐缓冲溶液浸提、硫酸铵沉淀、疏水色谱层析得到了高纯度的蒜头果蛋白(malanin)。实验发现最佳的硫酸铵饱和度区间是30%～50%，是蛋白集中沉淀区。蒜头果蛋白含有18种氨基酸，相对分子质量为61 875 Da，等电点为4.6，中性糖含量为6.0%，由A、B链通过二硫键连接而成。本研究发现蒜头果蛋白具有抑制Hela和Vero细胞体外生长的作用，且毒性非常大，具有用于免疫毒素治疗癌症的应用前景。蒜头果蛋白的理化性质以及细胞毒理学有待进一步深入研究。