超声吐温80提取杠板归多酚及其抗氧化活性研究

陈琼,吴菲菲,李化强,刘亚美,王恒震,张早明

(邵阳学院 食品与化学工程学院,湖南 邵阳,422000)

杠板归(polygonumperfoliatumL)是湖南特色中药材,又名犁头刺、贯叶蓼、蛇不过等,属于蓼科蓼属(polygonaceae),收载于《中华人民共和国药典》一部(2010年版)[1],杠板归是我们生活中常见的一种中草药[2],有研究表明,杠板归具有多种生物活性成分,主要有酚类、黄酮类、挥发油、蒽醌等[3-4]。其中多酚类化合物在清热解毒、利水消肿、蛇虫咬伤等方面起着不可或缺的作用,是杠板归中一种重要的生物活性物质[5-8]。目前,杠板归的研究主要集中在多糖和黄酮的提取及其药理作用[9-11],几乎没有关于杠板归多酚提取的报道。多酚的方法主要有机溶剂回流法、超声辅助提取法、酶法及超临界流体萃取法等[12-14]。而超声结合表面活性剂提取方法,主要是利用超声非热加工的特点,与表面活性剂的润湿、增溶作用相结合,达到节能省时、提高含量等效果,更有利于活性成分的溶出[15-17]。本试验中采用超声与吐温80协同提取法,通过正交试验优选杠板归多酚的提取工艺条件,并研究其体外抗氧化活性,为杠板归作为药食同源的开发应用潜力提供理论。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

杠板归:邵阳本地大药房,粉碎过80目(0.180 mm)筛备用；

没食子酸标准品、Folin-Ciocalteu试剂、抗坏血酸、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺为分析纯,生工生物工程(上海)股份有限公司；

吐温80、亚硝酸钠、铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸为分析纯,邵阳市科仪玻化有限公司。

1.2 仪器与设备

高速万能粉碎机:FW400A型,北京科伟永兴仪器有限公司；

真空冷冻干燥机:SCIENTZ-18N型,宁波新芝生物科技股份有限公司；

真空旋转蒸发仪:RE-5299型,巩义市予华仪器有限责任公司；

超声波清洗机:SB5200DTD型,宁波新芝生物科技股份有限公司；

紫外分光光度计:UV-1780型,日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 杠板归预处理及提取工艺

精密称取2 g(精确到0.000 1 g)的杠板归粉末置于100 mL的锥形瓶中,再加入一定量的吐温80水溶液进行超声提取,于10 000 r/min的条件下离心10 min后得上清液,过滤,合并滤液,得到待测液备用。

1.3.2 总酚含量的测定

1)没食子酸标准曲线的制定。以没食子酸为对照品,采用Folin-Ciocalteu法[18]测定多酚质量分数。在765 nm波长处测定吸光度,绘制没食子酸质量浓度(X)与吸光度(Y)的标准曲线。线性回归方程为Y=5.457 1X-0.007 9(R2=0.997 9),线性相关性良好。

2)样品中总酚质量分数的测定。按照标准曲线制作法测定吸光度,根据方程计算杠板归多酚得率。计算公式:

总酚得率=(C×V×n)/1 000/m×100%

式中:C为根据回归方程计算得到的质量浓度，g/L；V为提取液总体积，mL；n为稀释倍数；m为杠板归粉末的质量，g。

1.3.3 单因素实验设计

单因素实验探究了5个因素对杠板归多酚得率的影响,其中超声温度分别为40，50，60，70和80 ℃；吐温80质量浓度分别为10%，15%，20%，25%和30%；超声功率分别为150，180，210，240和270 W；液料比分别为10∶1 ，15∶1 ，20∶1 ，25∶1和30∶1 mL/g；超声时间分别为20，30，40，50和60 min。实验指标为杠板归多酚得率,每个重复3次。

1.3.4 正交试验

在单因素试验基础上,考察液料比(A)、超声时间(B)、吐温80质量浓度(C)、超声功率(D)、超声温度(E)5个因素,以多酚得率为指标进行正交试验,确定杠板归多酚的最佳提取工艺条件。因素水平表见表1。

表1 正交试验因素及水平
Table 1 Orthogonal test factors and levels

水平A液料比/(mL·g-1)B超声时间/minC吐温80质量浓度/%D超声功率/WE超声温度/℃110∶1201015040215∶1301518050320∶1402021060425∶1502524070

1.3.5 体外抗氧化活性研究

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声温度

超声温度对多酚得率的影响见图1。图1表明：在40～80 ℃的范围内,多酚得率先逐渐升高,随着温度的逐渐升高，各物质之间的运动速度增大,吐温80水溶液渗透到杠板归原料内的能力和多酚的溶解度增大,增加了多酚得率；而当提取温度过高时,其热不稳定性使多酚的化学结构遭到破坏,从而导致多酚得率下降。因此,确定60 ℃为较佳的提取超声温度。

图1 超声温度对多酚得率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic temperature on the extraction rate of polyphenols

图2 吐温80质量浓度对多酚得率的影响Fig.2 Effect of Tween 80 concentration on the extraction rate of polyphenols

2.1.2 吐温80质量浓度

吐温80质量浓度对多酚得率的影响见图2。图2表明：在吐温质量浓度为10%～20%时,多酚得率随着吐温80质量浓度的增加而呈现增大的趋势,这是由于吐温80作为增溶剂,更有利于多酚的溶出；但当质量浓度大于20%时,得率开始呈下降趋势,原因可能是当质量浓度过高时形成了胶束,多酚物质进入胶束中后再溶出受阻,导致多酚得率下降[22]。因此,确定20%为较佳的提取吐温80质量浓度。

2.1.3 超声功率

超声功率对多酚得率的影响见图3。图3表明：在150～270 W范围内,随着超声功率增大,杠板归多酚得率缓慢升高。这是由于超声波提取主要是利用超声波的特性,如温热效应使能量转换、物理化学变化等等,此时分子运动速度增大,从而加速多酚溶出,提高了多酚得率[23]。多酚得率在超声功率达到180 W时达到最高。因此,确定180 W为较佳的提取超声功率。

图3 超声功率对多酚得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of polyphenols

2.1.4 液料比

液料比对多酚得率的影响见图4。图4表明：在液料比为10∶1～30∶1 mL/g时,随着液料比的增大,杠板归多酚的得率先增后降,15∶1 mL/g时达到最大值。这可能是由于料液比较低时,原料和吐温80水溶液接触不充分,导致细胞中的多酚不易溶出；当体系中的溶剂量过多时,会降低超声波的超声效果,同时样品在后处理浓缩过程中多酚的损失增加[24]。因此,确定15∶1 mL/g为较佳的提取液料比。

图4 液料比对多酚得率的影响Fig.4 Effect of liquid to material ratio on the extraction rate of polyphenols

图5 超声时间对多酚得率的影响Fig.5 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of polyphenols

2.1.5 超声时间

超声时间对多酚得率的影响见图5。图5表明：在超声时间20～60 min范围内,随着超声时间的增加，多酚得率增加,在40 min时多酚的溶出量最大,提取效果最好,超声波对物料的作用较充分；之后再延长提取时间,多酚得率反而下降,超声波较强的剪切作用会破坏多酚的分子结构[25-26],并且多酚与外界环境接触时间过长也会导致氧化和分解[27]。因此,确定40 min为较佳的提取超声时间。

2.2 正交试验设计及结果

正交实验设计及结果见表2。

表2 正交实验设计及结果
Table 2 Design and results of orthogonal experiments

试验号ABCDE多酚得率/%11111116.9821222217.3131333317.5341444418.6352123417.1462214318.2272341218.0382432116.9793134218.53103243117.94113312418.11123421318.14134142317.54144231419.16154324118.09164413217.54K117.61317.54717.71218.07817.495K217.59018.15717.67017.48317.852K318.18017.94018.04717.53817.858K418.08317.82018.03518.36718.260R0.5900.6100.3770.8840.765最优方案A3B2C3D4E4

由表2看出各个单因素对杠板归中多酚得率的影响顺序为：D>E>B>A>C即超声功率>超声温度>超声时间>液料比>吐温80质量浓度。提取最佳工艺条件为A3B2C3D4E4,即液料比为20∶1 mL/g，超声时间为30 min，吐温80质量浓度为20%，超声温度为70 ℃，超声功率为240 W。

2.3 正交实验验证结果

根据正交实验中得到的最佳提取方案再次进行杠板归多酚的提取来验证实验结果。结果表明：当多酚提取效果高于以上16个试验组合时,多酚得率为(19.87±0.17)%,在此工艺条件下重复性好,稳定可行。

2.4 DPPH自由基清除能力的测定

多酚对DPPH自由基的清除能力见图6。由图6可知：杠板归多酚提取物(PPP)和VC都有清除DPPH自由基的作用；随着其质量浓度的不断增大,两者对DPPH自由基的清除能力随之逐渐增强最后趋于稳定；在质量浓度为30～150 mg/L时,杠板归多酚提取物对DPPH自由基的清除率最大达到73.34%,从整体来看,杠板归多酚提取物对DPPH自由基的清除能力强于VC。

图6 多酚对DPPH 自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability of polyphenols on DPPH radicals

图7 多酚对自由基的清除能力Fig.7 Scavenging ability of polyphenols on radicals

2.6 总还原能力的测定

先前已有报道,抗氧化活性与植物提取物的还原能力之间存在直接关联,化合物的还原能力可作为其潜在抗氧化活性的重要指标[28]。杠板归多酚提取物(PPP)和VC的还原能力如图8所示。从图8可见：在多酚质量浓度为30～150 mg/L时,随着多酚质量浓度的不断增大,两者的还原能力相应提高,且多酚提取物的还原能力大于同质量浓度的VC还原能力。从整体来看,杠板归多酚提取物的总还原能力强于VC。

图8 多酚的总还原能力Fig.8 Total reducing power of polyphenols

3 结论

杠板归多酚的最佳提取条件如下：液料比为20∶1 mL/g，超声时间为30 min，吐温80质量浓度为20%，超声温度为70 ℃、超声功率为240 W,在此条件下,多酚得率达到(19.87±0.17)%。杠板归多酚提取物具有较强的抗氧化活性,且清除效果与质量浓度相关,在相同质量浓度下，杠板归多酚提取物对DPPH自由基的清除率及总还原能力优于阳性对照VC。下一步还需对其进行分离纯化,对其结构、活性的研究深入探索,以鉴定出抗氧化的主要活性化合物。