Runt相关转录因子2蛋白表达与肺腺癌侵袭转移的关系

莘长明 乔高锋 张运曾 金锋

目前，肺癌的发病率和致死率在很多地区位居恶性肿瘤的首位[1]，80%以上的肺癌患者在临床诊断时已经发生了局部或远处的转移，肺癌的侵袭转移机制研究是目前肺癌研究的热点问题[2]。近年来，腺癌在肺原发恶性肿瘤中的占比明显增高，约占肺癌病例的一半以上，成为最常见的组织学类型之一[3]。

有研究[4]表明， Runt相关转录因子2( Runt-related transcription factor 2，Runx2)在乳腺癌等上皮性肿瘤中的表达水平较高，而肺腺癌组织中Runx2蛋白的表达及其意义尚不完全清楚。本研究通过检测肺腺癌组织、癌旁组织及正常肺组织中Runx2蛋白的表达情况，分析该蛋白表达与肺腺癌分化程度及转移、复发等临床参数的相关性，旨在为肺腺癌的治疗提供新的途径。

对象与方法

一、 研究对象

选取山东省胸科医院胸外科2016年12月—2017年6月接受手术治疗的49例肺腺癌患者的临床资料及病理标本(包括肺腺癌组织、癌旁组织及正常肺组织)。其中男性23例，女性26例，男女比例为1∶1.13；年龄35～71岁，中位年龄51岁；吸烟16例，不吸烟33例；原位腺癌或微浸润腺癌15例，浸润腺癌34例；有淋巴结转移15例，无淋巴结转移34例；随访至2019年12月，复发转移8例，无复发转移41例。

二、 Runx2蛋白表达检测

1. 主要试剂：Runx2抗体(Abeam，USA)，鼠兔通用二抗(中杉金桥)，DAB显色试剂盒(中杉金桥)，0.01 mmol/L PBS缓冲液(中杉金桥)，0.01 mmol/L枸橼酸缓冲液(pH值为6.0)(中杉金桥)，3%过氧化氢溶液(中杉金桥)，中性树胶(中杉金桥)，苏木精(中杉金桥)，TRIzol裂解液(Invitrogen，美国)，PVDF膜(Pall，0.22 um)等。

2. 免疫组织化学法：将病理切片置于60 ℃烤箱内2 h；常规二甲苯脱蜡20 min后更换新鲜二甲苯溶液继续浸泡20 min，然后分别用梯度乙醇(95%、85%、70%)浸泡，每次5 min，蒸馏水冲洗；切片放置于0.01 mmol/L(pH值为6.0)枸橼酸钠抗原修复液中，高压锅121 ℃抗原修复2 min，室温下自然冷却，PBS缓冲液冲洗3遍；滴入3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶，室温放置20 min，PBS缓冲液冲洗3遍，各5 min；滴加抗Runx2抗体(1∶200)，室温下静置30 min，4 ℃冰箱孵育12 h；从冰箱取出，自然恢复至室温，PBS缓冲液冲洗3遍，每次5 min；滴加通用型二抗，室温下置1 h；去除载玻片多余液体后，滴加新鲜配置的DAB液体，避光下控制染色时间(1～2 min)，放入蒸馏水中停止反应；苏木精复染2 min，蒸馏水洗脱，脱水透明，封片。

染色的判定：Runx2蛋白表达的阳性颗粒位于肺腺癌细胞的细胞核中。按染色强度：无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，深棕色为3分；阳性染色的范围定义：1分，<25%的肺腺癌细胞阳性表达；2分，25%～50%的肺腺癌细胞阳性染色；3分，51%～75%的肺腺癌细胞阳性表达；4分，>75%的肺腺癌细胞出现阳性表达。将上述2项评分相乘得到免疫评分即染色系数。在本研究中，将Runx2蛋白的染色系数≥8定义为高表达(阳性表达)，≤7为蛋白阴性/低表达。

3. Western blotting方法：取肺腺癌组织、癌旁组织、正常肺组织各49例，每例约50 mg，加入100 μL细胞裂解液，充分混匀后冰浴30 min，离心，收集上清液，沸水浴10 min；制备SDS-PAGE凝胶，转膜至PVDF膜；5%脱脂牛奶室温封闭1 h；弃封闭液，加入1：300的Runx2及β-actin一抗4 ℃过夜；PBS洗涤3次，每次5 min；以封闭液稀释二抗，室温孵育1 h，PBS洗涤3次，每次5 min；配置发光液；曝光。拍照记录并进行图像分析，测定组织中Runx2蛋白的相对表达量。

三、 统计学方法

应用SPSS 20.0软件进行数据分析。率的比较采用χ2检验，以P<0.05表明差异有统计学意义。

结 果

一、 Runx2蛋白在肺腺癌组织中的表达

免疫组织化学法检测结果显示：在49例肺腺癌组织中，Runx2蛋白在21例肺腺癌组织中呈现阴性/低表达，在28例肺腺癌组织中呈现高表达，阳性表达信号主要位于肿瘤细胞的胞核(图1)；癌旁组织中仅有4例为高表达；正常肺组织中Runx2蛋白表达均为阴性/低表达。肺腺癌组织、癌旁组织、正常肺组织Runx2蛋白阳性表达率分别为57.1%、8.2%、0，差异具有统计学意义(P<0.001)，详见表1。Western blotting检测结果证实Runx2蛋白在肺腺癌组织中的高表达情况(图2)。

二、 Runx2蛋白表达与肺腺癌临床参数的关系

Runx2蛋白在原位腺癌或微浸润腺癌、浸润性腺癌中的阳性表达率分别为13.3%(2/15)、76.5%(26/34)，差异具有统计学意义(P<0.001)；有淋巴结转移患者和无淋巴结转移患者的阳性表达率分别为86.7%(13/15)、44.1%(15/34)，差异具有统计学意义(P=0.006)；在34例浸润性腺癌中，高、中、低分化的阳性表达率分别为45.5%、77.8%、100%)，差异同样具有统计学意义(P=0.006)。在随访期内出现复发转移患者的Runx2蛋白阳性表达率为100%，明显高于无复发转移患者的48.8%(P=0.007)。Runx2蛋白的表达与性别、年龄、吸烟史、肿瘤直径无明显关系(P>0.05，表2)

图1 Runx2在肺腺癌组织中高表达(免疫组织化学染色SP法×400)

图2 Western blotting检测Runx2蛋白表达注：1.肺腺癌组织；2.癌旁组织；3.正常肺组织

表1Runx2蛋白在肺腺癌组织、癌旁组织、正常肺组织中的表达情况(n,N=49)

项目正常组织癌旁组织肺腺癌组织χ2值P值Runx2表达35.79<0.001 高表达0428 阴性/低表达494521

表2 Runx2蛋白表达与肺腺癌临床病理参数的关系(n)

讨 论

众多研究[5-9]证明，上皮间质转化是肿瘤侵袭转移的关键步骤，而Runx2是恶性肿瘤发生上皮间质转化的重要调控机制[9]，参与肿瘤浸润、转移过程，这也成为近年来肿瘤转移研究的热点方向。Runx2可以调节骨基质和黏附蛋白、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)及血管内皮生长因子等与肿瘤转移密切相关蛋白的表达[10-12]。研究[13-14]发现，Runx2在骨肿瘤、前列腺癌、乳腺癌等实体肿瘤中存在明显的表达上调，并且在调节这些肿瘤的骨转移微环境过程中起着关键作用，Runx2的表达与上述恶性肿瘤的预后呈明显的负相关。但目前国内外较少有关于Runx2与肺腺癌关系的相关研究。

本研究采用免疫组织化学及Western blotting方法检测了肺腺癌、癌旁组织和正常肺组织中Runx2蛋白的表达情况。结果表明，Runx2蛋白在肺腺癌组织中存在高表达的现象；进一步通过分析临床资料证实：浸润性生长、分化程度低、有淋巴结转移、随访期内复发转移的病理标本中Runx2蛋白的阳性表达率明显升高，这些指标都是公认的恶性肿瘤预后差的重要因素，提示Runx2蛋白的高表达与肺腺癌的不良预后密切相关。这与Li等[15]的研究结果一致，该研究对121例非小细胞肺癌患者肺癌病理标本进行免疫组织化学分析，Runx2蛋白的表达与肺癌的分期、淋巴结转移和预后均密切相关；但其研究也表明，肿瘤直径>3 cm组织中Runx2蛋白的表达率要明显高于肿瘤直径≤3 cm者；本研究未能证实Runx2蛋白的表达与肿瘤直径的相关性；国内学者高鹏等[16]的研究也证明Runx2蛋白表达与肿瘤大小无关。关于Runx2蛋白在肺癌侵袭转移的作用机制研究，近几年也逐渐有文献涉及。Tandon等[17]发现，Runx2可通过抑制MMP的表达进而促进肺癌细胞增殖及侵袭转移特性。Herreo等[18]证实，Runx2可上调上皮间质转化相关基因的表达，进而增强肺癌细胞的侵袭转移能力。耿文文等[19]研究表明，沉默Runx2基因的表达可以阻止肺癌细胞系上皮间质转化的发生，从而延缓癌细胞的远处转移。

综上所述，Runx2可通过调控上皮间质转化的过程，促进肿瘤细胞的转移；Runx2蛋白的高表达与肺腺癌的低分化、高侵袭转移特性及复发关系密切；Runx2蛋白可能成为检测肺腺癌分化及判断预后的标志物；抑制Runx2蛋白的表达或沉默Runx2基因或许可以对预防肺腺癌的侵袭转移起到重要作用。