庆阳市庆城县退耕还林区土壤纤毛虫群落特征

宁应之，徐富荣，王婷婷

1.西北师范大学生命科学学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃农业大学基础实验教学中心，甘肃 兰州 730070

退耕还林工程是指将水土流失、沙漠化、盐碱度高及石漠化等不适宜种植作物的耕地，结合当地实际状况，有计划有步骤地种草造林恢复植被，旨在通过人工植树造林的方法恢复和保护生态环境（鄢富成等，2017）。近年来，随着生态恢复进程的加速，自然环境状况有了明显的改善，关于退耕还林生态恢复的相关研究也越来越多，主要集中于土壤环境的改变（兰志龙等，2017；段亚锋等，2018；梁海斌等，2018）、植被类型的选择（赵安周等，2017）、退还模式的比较（马少薇等，2016）、微生物群落变化（陈孟立等，2018）和土壤动物群落变化（赵娟等，2019）等方面。

土壤纤毛虫作为一类最复杂和最高等的单细胞真核生物，是土壤原生动物中的一个重要组成部分，具有物种多样性高、生长周期短、细胞膜纤薄、相对容易分离、培养和观察等特点，因此常被作为一种指示生物用于评价土壤生态环境（周可新等，2003；李琦路等，2008；Foissner，1999）。近年来有关土壤纤毛虫领域的研究逐渐增多，主要涉及利用分子信息结合形态学和细胞发生学对其进行分类学研究（Li et al.，2018；Wang et al.，2016）、不同生态环境对其群落组成的影响（孙辉荣等，2017）、结合分子生物学技术探究其系统发育机制等多个方面（Wang et al.，2017）。有关农田退耕还林后土壤纤毛虫群落结构变化的研究则较为稀缺，目前仅见宁应之等（2011，2016，2017a，2018，2019）相关报道。

庆阳市庆城县位于甘肃省东部，是甘肃省实行退耕还林生态工程的试点之一。宁应之等（2017a）已对庆城县退耕还林区春季土壤纤毛虫群落进行研究，但由于监测时间过短，未能全面反映该地区退还效果。本文以庆阳市庆城县退耕 10年后的多树种混交林和单一树种经济林为研究对象，以农田作为对照，分别在春、夏、秋、冬4个季节进行采样，探讨不同退还模式对土壤纤毛虫群落特征的影响，分析土壤纤毛虫群落特征参数与环境因子间的相关关系，旨在为该地区退耕还林模式的选择及退还效果生物学评价提供理论依据和参考资料。

1 研究样区与研究方法

1.1 研究区概况

研究区位于甘肃省东部庆阳市庆城县境内（图1），地处陇东黄土高原中部地带，地理位置35°59′—36°05′N，107°46′—107°53′E，东西长约 70 km，南北宽约56 km，总土地面积2692.6 km2。全县残塬沟壑与丘陵沟壑地貌广泛分布，气候属于温带大陆性季风气候，年平均气温9.4 ℃，年平均降水量537.5 mm，土壤类型以黄绵土为主。主要植物有山杏（Armeniaca sibirica）、刺槐（Robinia pseudoacacia）、侧柏（Platycladus orientalis）、酸枣（Ziziphus jujuba）、硬质早熟禾（Poa sphondylodes）、茵陈蒿（Artemisia capillaries）、矮蒿（Artemisia lancea）和紫花苜蓿（Medicago sativa）等。

1.2 研究方法

1.2.1 样地设置及采样

在庆城县境内选择2个大小、坡度和土壤类型等本底条件基本一致的退耕 10年林地作为实验样地，分别是山杏+侧柏+刺槐混交林（APR）和山杏经济林（A），并在这两个林地附近各选择一个农田作为对照，分别是种植玉米+韭菜农田（CK1）和玉米+大豆农田（CK2）（图1）。

在每个样地中设置5个面积为25 m2（5 m×5 m）平行样方，每个小样方按照“梅花五点式”取样法采集土样，采集土样时需拣去覆盖在土层表面的枯枝落叶层，采集0—5 cm的表层土样，取实验所需适量土样混匀装入塑料袋中，并做好标记，4个样地共计20份土样。同时用容积为100 cm3的土壤环刀取样器切割原位土，使土样充满其中，封闭装好带回实验室做土壤孔隙度和含水量的测定。同时记录样地海拔、经纬度、土壤温度和植被状况。将采集的新鲜土样分两部分处理，一部分土样用于测定pH和电导率，另一部分土样室内自然风干，风干土样时需用草纸将其覆盖，以防外界空气中的包囊进入土样影响实验结果（宁应之等，2018）。

1.2.2 纤毛虫研究方法

定性研究采用“非淹没培养皿法”（Foissner，1992）。取50 g风干土样放入直径15 cm的培养皿中，加入土壤浸出液使其处于过饱和状态，光照培养箱中25 ℃下培养24 h后镜检，连续观察记录20 d。采用活体观察法并结合参考资料（Berger，1999，2011；Foissner，1993，2000；沈韫芬，1990；宁应之等，1998）进行分类鉴定。

定量研究采用培养直接计数法（宁应之等，2017a，2019）。取30 g风干土样于直径9 cm的培养皿中，加入30 mL土壤浸出液，用记号笔标记出液面刻度线，放入光照培养箱中25 ℃恒温培养。使液面保持在刻度线处直至最大计数日（第7、9、11天），45°倾斜培养皿约5 min，吸取土壤悬浮液并计量，分别取5滴土壤悬浮液于显微镜下计数，得出平均1 mL（1 mL约为22滴）悬浮液中土壤纤毛虫数量，最后换算成30 g风干土样中的纤毛虫总量。

1.2.3 土壤理化因子测定

图1 研究区地理位置Fig.1 Location of studied area

采用电位法测定pH值，使用仪器为TSS-851土壤湿度酸度计（四平市电子技术研究所）；采用浸提法测定电导率；利用曲管地温计测定土温；采用烘干法测定土壤含水量（李广文等，2009）；采用环刀法测定土壤孔隙度（袁久坤等，2014）；使用常规方法测定总氮、总磷、总钾、速效氮、速效磷和有机质。

1.3 数据处理及分析

Shannon-Wiener指数：

Simpson指数：

Margalef指数：

Pielou指数：

式中：S为物种数；Pi为第i类群的百分比；N为纤毛虫总个体数。

C/P系数是指肾形纲纤毛虫（r-selected species）种类数与异毛纲、旋毛纲和瓶纤纲纤毛虫（k-selected species）种类数的比率即为C/P系数，它在一定程度上反映土壤纤毛虫生存环境的优劣（Foissner et al.，2005）。

对各样地所测数据（土壤理化因子和纤毛虫群落特征参数）采用单因素方差分析（One-way ANOVA）；对平均数采用LSD进行多重比较分析；对土壤理化因子与纤毛虫群落特征参数进行 RDA分析与Pearson相关性分析。采用SSPS 19.0软件对所有数据进行处理；采用 PRIMER 6进行 Cluster分析；采用Canoco 4.5进行RDA分析；采用Origin 8.0绘制柱状图。

2 结果与分析

2.1 土壤理化因子

各样地土壤理化因子如表1所示，其中含水量、土壤孔隙度、有机质、总氮均表现为退耕样地显著高于农田对照样地（P＜0.05），且混交林大于经济林；pH、电导率、速效磷均表现为农田对照样地CK1、CK2显著高于退耕样地APR、A（P＜0.05），原因是农田常年施肥影响；土壤温度、总磷、速效钾均表现为CK1样地显著高于APR、A、CK2样地（P＜0.05）；总钾含量表现为CK2样地显著高于APR、A、CK1样地（P＜0.05）；速效氮在各样地间差异不显著（P=0.392，F=1.064）。

对各样地土壤理化因子进行Cluster分析如图2所示。APR样地和A样地在欧式距离1处最先聚在一起，随后在2.5处和CK2样地聚在一起，最后和CK1样地聚在一起。说明退耕样地与农田对照样地的土壤理化因子具有差异，其中APR样地和A样地土壤理化性质相似性较高，CK1样地和CK2样地土壤理化性质相似性较高。

2.2 植物群落特征参数

采用Engler et al.（1964）分类系统对2个退耕样地植物进行分类研究，共统计到植物35种，隶属于2门3纲17目21科31属，其中，乔木4种，占11.43%，；灌木4种，占11.43%；草本27种，占71.43%。由表2可知，APR样地植物物种数最多，共计31种，A样地植物物种数较少，共鉴定到20种；除Simpson指数（APR＜A）外，植物群落特征参数均表现为：APR＞A。综上所述，混交林APR样地植物较为丰富，群落结构较稳定，退还效果较好。

2.3 土壤纤毛虫群落特征参数

2.3.1 土壤纤毛虫群落组成与物种分布

由表3可知，4个样地中共鉴定到土壤纤毛虫127种，隶属于10纲21目34科52属，各样地土壤纤毛虫群落组成存在一定差异，退耕样地纤毛虫群落组成较农田对照样地更为复杂，物种数更多，且在目、科、属水平上呈现明显增加趋势。各样地土壤纤毛虫优势类群发生明显的演替，由农田样地的肾形目（Colpodida）逐渐过渡为退耕样地的散毛目（Sporadotrichida）。

表1 各样地土壤理化因子Table 1 Soil physic-chemical factors in various sampling plots

图2 各样地土壤理化因子的Cluster分析Fig.2 The cluster analysis on soil physic-chemical factors in various sampling plots

表2 各样地植物群落特征参数Table 2 Parameters of plant community in various sampling plots

对各样地的土壤纤毛虫物种分布进行 Cluster分析（图3），结果表明，CK1样地与CK2样地聚为一类，APR样地与A样地聚为一类，最后农田对照样地与退耕样地汇合。由此表明，APR样地与A样地物种分布极为相似，而与CK1和CK2相异。退耕还林使土壤纤毛虫群落变的更加复杂多样，相较于农田样地，退耕样地的物种分布更具相似性。

2.3.2 广布种和特有种

在 4块样地中均有分布的土壤纤毛虫共有 17种，为广布种，占所观察到纤毛虫总物种数的13.39%；分别是活动恩氏虫（Engelmanniella motabilis）、长颗粒尖毛虫（Oxytricha longigranulosa）、叶绿尖毛虫（Oxytricha chlorelligera）、尖锐片尾虫（Urosoma acuminata）、巨片尾虫（Urosoma gigantean）、绿全列虫（Holosticha viridis）、瘦尾虫属一种（Uroleptussp.2）、急游虫属一种（Strombidiumsp.）、俏篮口虫（Nassula gracilis）、篮口虫属一种（Nassulasp.1）、篮口虫属一种（Nassulasp.2）、僧帽肾形虫（Colpoda cucullus）、豆形肾形虫（Colpoda colpidiopsis）、简裸口虫（Holophrya simplex）、膜袋虫属一种（Cyclidiumsp.）、瞬目虫属一种（Glaucomasp.）和钩刺斜管虫（Chilodonella uncinata）。

表3 各样地土壤纤毛虫群落组成Table 3 Community composition of soil ciliates in various sampling plots

图3 各样地土壤纤毛虫物种分布的Cluster分析Fig.3 The cluster analysis on species distribution of soil ciliates in various sampling plots

仅在一个样地出现的种为特有种，退耕样地特有种有 60种，占鉴定到土壤纤毛虫物种总数的47.24%；农田对照样地特有种有 14种，分别是长赭虫（Blepharisma elongatum）、游溢尖毛虫（Oxytricha ludibunda）、变藓斯道克虫（Sterkiella histriomuscorum）、斯道克虫属一种（Sterkiellasp.）、丛林尾全列虫（Caudiholosticha sylvatica）、苔叶虫属一种（Bryophyllumsp.）、克氏裂口虫（Amphileptus claparedei）、小肾形虫（Colpoda minima）、直立肾形虫（Colpoda praestans）、大肾形虫（Colpoda magna）、篮环虫属一种（Cyrtolophosissp.）、大口匙口虫（Platyophrya macrostoma）、裸口虫属一种（Holophryasp.）和梨形四膜虫（Tetrahymena priformis）。退耕样地特有种数量远远大于农田对照样地，说明退耕还林使土壤生态环境得到一定程度改善，从而更有利于纤毛虫生存和繁殖。

2.3.3 土壤纤毛虫群落特征参数

如图4所示，土壤纤毛虫物种数在4个季节中APR样地最多，分别为：春季（52种）、秋季（43种）、夏季（40种）、冬季（24种）；CK2样地物种数最少，分别为：春季（29种）、秋季（19种）、夏季（10种）、冬季（6种），总体变化趋势为：APR＞A＞CK1＞CK2。土壤纤毛虫密度4个季节中表现为APR样地（春季：160.20 ind·g-1、夏季：179.09 ind·g-1、秋季：138.72 ind·g-1、冬季：133.34 ind·g-1）显著高于 CK1 样地（春季：34.58 ind·g-1、夏季：31.69 ind·g-1、秋季：23.43 ind·g-1、冬季：27.39 ind·g-1）和 CK2 样地（春季：41.11 ind·g-1、夏季：49.02 ind·g-1、秋季：52.39 ind·g-1、冬季：23.23 ind·g-1）（P＜0.05），总体变化趋势为：APR＞A＞CK2＞CK1。土壤纤毛虫C/P系数4个季节总体表现为：CK2＞CK1＞A＞APR，农田对照样地土壤纤毛虫C/P系数大于退耕样地，说明农田对照样地的土壤环境较为贫瘠，分布的土壤纤毛虫以较为低等的肾形类为主。

图4 各样地土壤纤毛虫物种数、密度和C/P系数Fig.4 Species number,density and C/P inde of soil ciliates in various sampling plots

如图 5所示，各样地土壤纤毛虫 Shannon-Wiener指数与 Margalef指数 4个季节变化趋势相同，即：APR＞A＞CK1＞CK2，且退耕样地与农田对照样地差异显著（P＜0.05）。土壤纤毛虫Pielou指数4个季节变化趋势为：APR＞CK2＞CK1＞A，且退耕样地与农田对照样差异不显著（P＞0.05）；土壤纤毛虫Simpson指数4个季节变化趋势为：A＞APR＞CK1＞CK2，且退耕样地与农田对照样地差异不显著（P＞0.05）。

总体来看，土壤纤毛虫物种数、密度、Shannon-Wiener指数、Margalef指数和Pielou指数总体表现为退耕样地高于农田对照样地，且混交林高于经济林。4个季节混交林的Simpson指数低于经济林，基本符合物种越丰富，其Simpson指数越低的变化规律。这说明退耕还林后地下土壤环境发生了明显的改变，从而改善了土壤动物的生存环境，更有利于纤毛虫物种多样性的提高。

图5 各样地土壤纤毛虫Shannon-Wiener指数、Margalef指数、Pielou指数和Simpson指数Fig.5 Shannon-Wiener index,Margalef index,Pielou index and Simpson index of soil ciliates in various sampling plots

2.3.4 土壤纤毛虫群落特征参数与土壤理化因子的Pearson相关性分析

如表4所示，Pearson相关性分析结果为：土壤孔隙度、总氮、有机质和含水量与Shannon-Wiener指数、密度及 Margalef指数呈极显著正相关（P＜0.01）；总磷与纤毛虫Simpson指数呈显著负相关（P＜0.05）；速效磷与纤毛虫密度、Margalef指数呈极显著负相关（P＜0.01），与Shannon-Wiener指数呈显著负相关（P＜0.05）；pH 值与Shannon-Wiener指数、密度、及Margalef指数呈极显著负相关（P＜0.01）；电导率与Shannon-Wiener指数及Margalef指数呈极显著负相关（P＜0.01），与密度呈显著负相关（P＜0.05）。由此可见，土壤孔隙度、总氮、有机质、pH、电导率和含水量是影响纤毛虫群落组成的重要土壤理化因子。

2.3.5 土壤纤毛虫群落特征参数与土壤理化因子的RDA分析

利用Canoco 4.5软件对土壤理化因子与土壤纤毛虫群落特征参数进行相关性分析，为确定选择线性模型还是单峰模型，首先通过对土壤纤毛虫群落特征参数与土壤理化因子进行 DCA分析，得到 4个排序轴的最大梯度为 0.503远远小于 3，因此选择线性模型 RDA分析来探究土壤纤毛虫群落组成参数与土壤环境因子的关系。

将 12种土壤理化因子和纤毛虫群落特征参数进行排序（表5），第1排序轴贡献率为54.2%，第2排序轴贡献率为18%，累计贡献率达72.2%，能较好的显示出纤毛虫和土壤环境因子间的关系。第1排序轴与有机质的相关性最大，总氮次之，表明排序轴1主要反映有机质、总氮和纤毛虫群落的相关关系；第2排序轴与土壤孔隙度相关性最大，表明排序轴2主要反映土壤孔隙度与纤毛虫群落的相关关系。

以第1排序轴为横坐标，第2排序轴为纵坐标，将 12种土壤理化因子和纤毛虫群落特征参数进行RDA分析（图6），图中1—4表示春季的APR样地、CK1样地、A样地、CK2样地，5—8为夏季各样地，以此类推。由图可知，土壤纤毛虫群落特征参数（Simpson指数、Margalef指数、Shannon-Wiener指数、物种数、密度）与土壤孔隙度、有机质和总氮呈正相关，与pH呈负相关，其他理化因子对土壤纤毛虫群落特征参数影响相对较小。所以，有机质、总氮、土壤孔隙度、pH是影响土壤纤毛虫群落组成的关键因子。

表4 土壤纤毛虫群落特征参数与土壤理化因子的相关性分析（皮尔森相关性系数）Table 4 Relationships between the community characteristic parameters of soil ciliates and the soil physic-chemical factors (Pearson’s correlation coefficient)

表5 环境变量与排序轴的相关性Table 5 Correlation of environmental variables with axis

3 讨论

3.1 退耕还林生态恢复对植被的影响

退耕还林工程实施的最终目的是通过提高植物物种多样性，进一步加强和巩固生态系统结构与功能（杨琴美，2018）。人类作为生态系统中必不可少的组成部分，其对生态系统的干扰作用越小，越有利于草木本等植物的生长和繁殖以及凋落物的积累，混交林相对于经济林人为干扰较少，从而有效的保留了林地内自然分布的植物类型，使群落环境得到发展和改善的同时，其物种多样性也随之提高（王芸等，2013）。其中混交林植物物种数、密度、盖度、Shannon指数、Pielou指数和Margalef指数均大于经济林，表明混交林植物类型较经济林复杂，形成的枯枝落叶及地表腐殖质较多，能有效地提高土壤保水力和土壤保育功能（田宁宁等，2015；李亚男，2015），从而增强了生态系统的碳储量和固碳能力（田大伦等，2010），使其生物多样性更高，微生物活动更频繁（薛萐等，2007）。张中开（2015）研究了福建省永定县纯树种林及混交林的植物盖度、土壤理化性质、水土流失等情况，发现混交林各方面功能特性均优于纯树种林，这与本研究的结果相一致。

图6 物种-理化因子相关RDA排序图Fig.6 RDA analysis ordination diagram of the species and physic-chemical relationship

3.2 退耕还林生态恢复对土壤理化因子的影响

土壤环境受地上植物物种多样性不同而发生明显改变，不同退还模式对土壤理化因子产生的影响不同。本研究发现退耕还林后各样地土壤理化因子产生不同程度的变化，其中含水量、土壤孔隙度、有机质和总氮比农田对照样地分别提高了26.43%、7.97%、44.46%和33.27%，这与已有的结果相一致（张晓霞等，2017；李静等，2017；王月玲等，2017）。说明退耕还林后，植被覆盖率增加，植物根系发达，提高了土壤的保水和锁水能力，减少了地表水分的蒸发，加速了林下凋落物的沉淀分解作用，从而有利于土壤养分积累。而农田样地中氮、磷、钾含量较高可能与施肥和大豆的固氮作用有关，单从两个退耕样地来看，植被恢复对土壤氮、磷、钾含量的积累还是具有一定的作用。由此说明，退耕还林工程使植被恢复的同时也有效地改良了土壤环境状况。

3.3 退耕还林生态恢复对土壤纤毛虫群落的影响

退耕还林最为直接的影响是改变植物群落组成，进而改善了土壤环境，土壤纤毛虫作为一种良好的环境指示生物，其各项群落特征参数及动态变化可以用来反应生态环境变化（宁应之等，2017a）。研究结果表明，退耕还林后土壤纤毛虫密度、Shannon-Wiener指数和Margalef指数均有所提高，总体趋势表现为：混交林＞经济林＞农田，说明混交林植被恢复最好，物种最丰富，凋落物最厚，土壤环境最优越，更有利于土壤纤毛虫的生长和繁殖，这与已有的结果相一致（宁应之等，2016，2017a，2019）。退耕样地与农田对照样地相比土壤纤毛虫优势类群发生了明显的演替，总体表现为由农田样地的r-对策者肾形目（Colpodida）逐渐过渡为退耕样地的K-对策者散毛目（Sporadotrichid）。肾形目纤毛虫由于其体型及食性的特殊性可抵御极端环境，可在人为干扰严重、植物盖度低、含水量不高的土壤环境中占优势（Bamforth，2010）。而散毛目纤毛虫由于其体型较大，主要摄食腐烂物质及菌类，对生长环境的要求较为苛刻，这与已有的研究结果一致（宁应之等，2016，2017a，2019）。C/P系数结果显示4个季节农田样地的土壤纤毛虫C/P系数均大于退耕样地。表明农田样地较退耕样地土壤腐殖质较少，土壤环境较为贫瘠，土壤纤毛虫生存环境更为恶劣，从而使土壤纤毛虫群落组成趋于简单和低等（宁应之等，2017b）。相关性分析显示，土壤纤毛虫群落特征参数与孔隙度、有机质和总氮呈极显著正相关，与pH呈极显著负相关，该结论与已有研究结果一致（邹涛等，2009；秦洁等，2010）。土壤纤毛虫作为一种良好的环境指示微型生物，其各项群落特征参数均对退耕还林生态修复工程发生了积极的响应，通过比较两种不同退还模式下土壤纤毛虫群落特征，发现混交林中土壤纤毛虫群落组成更为丰富，群落结构更为稳定，说明混交林中植物物种多样性更丰富、植物盖度更高、土壤表层凋落物更多，微生物繁殖与生长更旺盛，土壤环境更优越。因此在退耕还林模式的选择中建议以多数种混交林恢复方式为主。

4 结论

研究结果显示，随着退还工程的实施，土壤环境得到有效的改善，含水量、土壤孔隙度、有机质、总氮含量均明显增高，土壤纤毛虫群落结构趋于稳定和复杂，纤毛虫密度、Shannon-Wiener指数、Margalef指数增高。相关性分析结果表明，有机质、总氮、土壤孔隙度、pH是影响土壤纤毛虫群落组成的关键因子。由此可以说明，甘肃省庆阳市庆城县退耕还林区土壤纤毛虫群落对该地区退耕还林生态恢复发生了积极的响应。土壤纤毛虫作为良好的环境指示生物，其各项特征参数可以作为评价生态恢复效果的重要指标。

致谢：感谢英国自然历史博物馆原生动物学专家、高级研究员Alan Warren为本文的英文摘要提供了指导意见。