杭州和泰安地区3个甜樱桃品种花器官发育质量比较分析

沈国正，刘辉，张琛，郗笃隽，裴嘉博，黄康康

（杭州市农业科学研究院园艺研究所，杭州 310024）

甜樱桃（Pruns aviumL.），俗称大樱桃，是我国北方落叶果树中果实成熟最早的树种之一，集中栽培于泰安、烟台、大连等地。近10年来，甜樱桃栽培区域已逐渐向南方地区扩展，包括长江中下游的江浙沪地区。南方地区春季升温早、快，甜樱桃露地栽培可比北方更早上市；同时，随着“休闲采摘”果树种植模式的兴起，南方地区甜樱桃产业发展前景广阔。但在生产实践中，南方地区甜樱桃栽培存在坐果率低、结实不良和畸形果多等问题。

花器官尤其是雌雄配子体的发育与坐果、果实品质密切相关。雌雄配子体的正常发育，可为后续授粉受精、坐果和果实正常发育奠定良好基础，否则将导致坐果率低、果实畸形、小果等现象发生[1]。王世平等[2]和李勃等[3]对上海地区甜樱桃花器官的研究表明，胚珠、胚囊发育不良比例高是上海甜樱桃不能正常结实的主要原因。由于前人对这一问题的研究多集中于南方地区种植的甜樱桃需冷量不足[4-5]和高温对花芽分化过程的影响方面[6-7]，但关于南方引种区与适栽区的甜樱桃花器官与花粉发育质量间的差异还未见报道。因此，本文在课题组前期研究基础上，选取每年均有一定坐果率但不稳定、低温需冷量不同的3个代表性甜樱桃品种为试验材料，对比了相同甜樱桃品种在杭州（南方地区）和泰安（北方地区）雌雄配子体的发育状况、花器官的发育质量及花粉质量，以期揭示杭州地区甜樱桃坐果率低的原因，为今后杭州地区及类似生境区域甜樱桃种植制定合理的增产措施、调控其生长发育和达到稳产优产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试用甜樱桃分别种植于浙江省杭州市新登镇甜樱桃研究基地（29°58′11.49″N，119°43′46.66″E）、山东省泰安市高新区红旗樱桃合作社种植基地（36°11′07″N，117°06′51″E），供试品种分别为‘萨米脱’（‘Summit’）、‘布鲁克斯’（‘Brooks’）、‘拉宾斯’（‘Lapins’），树龄均为 4 a。杭州基地内甜樱桃采用起垄、避雨栽培方式：定植垄高45 cm、宽150 cm，株距3 m，单行种植；避雨棚为单拱圆形钢管大棚，棚跨度4 m、肩高3.6 m、脊高4.5 m，夏季遮阳。泰安基地内甜樱桃采用当地常规栽培方式，露天栽培，株行距3 m×4 m。

1.2 测定指标及方法

甜樱桃物候期观察：分别观察并记录2个地区各品种甜樱桃花芽萌发期、芽鳞开裂期、现蕾期及开花期。其中：以全树5%花芽萌动记录为花芽萌发期，全树5%芽鳞开裂记录为芽鳞开裂期，全树5%现蕾记录为现蕾期，全树5%开花记录为开花期。

花器官质量测定：开花当日采集各品种花20～30朵，用游标卡尺测量并记录每个品种的雌雄蕊长度、子房直径、雄蕊数目等指标。

花粉质量测定：于花期采集不同品种即将开放的大花蕾带回实验室，及时剥取花药，摊在硫酸纸上阴干后装于玻璃小瓶中，于4℃条件下贮存，备用。花粉质量包括花粉量、花粉活力及花粉萌发率等指标。

花粉量的测定参照沈根华等[8]的方法并略有修改：随机取饱满、未开裂花药50粒放入2 mL离心管中，重复3次。在25℃环境中放置24 h至花粉完全散出，加入200 g/L六偏磷酸钠溶液2 mL，在漩涡振荡器上振荡成悬浮液。取悬浮液400 μL于2 mL离心管中，加入200 g/L六偏磷酸钠溶液1 600 μL并摇匀，取5 μL于载玻片上，然后置于AE2000倒置生物显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）下观察，统计花粉粒数，重复3次。每枚花药的花粉量（花粉粒/花药）=每个载玻片上总花粉粒数×40。

花粉活力的测定采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC）法并稍加改进：取少量花粉到500 μL含0.5%TTC溶液中，混匀，然后置于35℃恒温箱中（避光），染色24 h后吸取少量溶液到载玻片上，盖上盖玻片并在BX53光学显微镜（奥林巴斯株式会社，日本）下观察。分别统计3个视野。花粉活力/%=（着色花粉数/观察花粉数）×100。

花粉萌发率的测定参照姜雪婷等[9]的方法并略有修改：将培养液（蒸馏水+20%蔗糖+0.1%硼酸，pH 6.5）滴于具圆形凹槽的载玻片上，用样品针蘸取适量花粉播于培养液中，然后将载玻片置于底部垫有湿润滤纸的培养皿内，于25℃条件下培养4 h后终止培养。利用BX53光学显微镜观察花粉萌发情况，每个品种3次重复。每个重复观察不少于3个视野，每个视野花粉粒不少于30个，以花粉管长度大于花粉粒直径视为萌发。萌发率/%=已萌发花粉数/花粉总数×100。

花芽分化期及花期温度记录：用Testo 176自动记录仪分别记录泰安、杭州两地甜樱桃花芽分化期和花期的日最高气温和最低气温；自落叶开始计算有效低温积累量，采用0～7.2℃模型评价需冷量。

1.3 数据统计分析

采用Excel 2016和DPS 14.5软件对数据进行统计分析，采用单因素方差分析中的邓肯法比较不同处理间的差异显著水平。

2 结果与分析

2.1 杭州和泰安地区甜樱桃花期物候期差异比较

于花芽萌动前对两地甜樱桃品种花器官发育阶段物候期观察记录的结果（表1～2）表明，2017年‘萨米脱’‘布鲁克斯’‘拉宾斯’3个品种在杭州地区从花芽萌动至开花分别需要27、23、25 d，在泰安地区分别需要24、23、25 d。其中，杭州地区‘萨米脱’花器官发育所需时间最长，该品种花器官发育所需天数长于泰安地区。2018年3个品种甜樱桃花器官发育时间较2017年长，‘萨米脱’‘布鲁克斯’‘拉宾斯’在杭州地区分别需要30、27、27 d，在泰安地区分别需要26、25、26 d。结合2年数据可知，杭州地区3个品种从花芽萌动至开花需23～30 d，泰安地区花芽萌动虽较杭州地区晚，但花器官整体发育所需天数较杭州短1～4 d。3个品种发育进程间隔2～3 d，其发育进程速率为‘布鲁克斯’＞‘拉宾斯’＞‘萨米脱’。

2.2 杭州和泰安地区甜樱桃雌雄配子体发育过程分析

通过石蜡切片观察可知，两地区3个品种甜樱桃在落叶前出现胚珠原基的突起，均以胚珠原基形态越冬，在休眠期内都无明显形态变化。花芽萌动后，雌配子体发育经过胚珠原基、胚珠分化初期、分化出珠心和珠被、分化出大孢子母细胞、胚囊发育5个阶段，直至胚发育成熟。雄配子体方面，两地区3个品种甜樱桃均以小孢子母细胞形态越冬，在休眠期内都无明显形态变化；但在同一花药的不同药室，小孢子母细胞的发育阶段不同，同一花序、不同花朵的发育状态不同。于花芽萌动后，雄配子体发育经过小孢子母细胞、四分体、花粉粒3个阶段，直至花粉发育成熟。结合物候期的记录及石蜡切片对比可知甜樱桃花芽分化期内外形态变化，其中：雄配子体约于花前1周发育为成熟的花粉粒，此时花芽外观为现蕾期；雌配子体于花前0 d完成胚珠与胚囊的发育。

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表1 2017年度杭州和泰安地区3个甜樱桃品种花器官发育阶段物候期调查结果Table 1 Phenological calendar of three sweet cherry cultivars during floral organ development in Hangzhou and Tai'an areas in 2017

表2 2018年度杭州和泰安地区3个甜樱桃品种花器官发育阶段物候期调查结果Table 2 Phenological calendar of three sweet cherry cultivars during floral organ development in Hangzhou and Tai'an areas in 2018

图1 杭州地区甜樱桃雄配子体的异常发育类型Fig.1 Abnormal development types of male gametophyte of sweet cherries in Hangzhou area

对两地区甜樱桃雌雄配子体在各个阶段发育的比较发现，相同品种在两地间的差异表现为部分发育时期的异常发育状况。由图1可知：杭州地区甜樱桃雄配子体在单核及二核花粉发育阶段部分发生退化或降解，形成多种发育异常类型，此类型将导致雄配子体败育，在后期花粉粒成熟阶段观察到花粉囊中形成的花粉极少，几乎为空花粉囊，且比例较高；而泰安地区甜樱桃雄配子体花粉囊均较饱满。花粉囊是贮藏花粉的场所，花粉囊中花粉粒数量较少可能与前期发育阶段发生的降解有关。空花粉囊或花粉囊中花粉较少表明杭州地区甜樱桃的花粉粒数量较少。同时，杭州地区甜樱桃雌配子体的胚珠和胚囊发育状况也较差，出现胚珠退化、大孢子母细胞在发育过程中退化、无胚囊发育等异常类型（图2）。对杭州地区雌配子体切片进行统计并对2年数据的平均值进行分析发现：‘萨米脱’‘布鲁克斯’‘拉宾斯’正常发育比例仅为25.33%、16.46%、13.33%，大部分为有胚珠、无胚囊的雌配子体类型（‘萨米脱’68.00%、‘布鲁克斯’67.08%、‘拉宾斯’82.50%），剩余的为无胚珠类型，而后2种发育类型均为雌配子体败育类型。说明杭州地区甜樱桃雌配子体败育比例较高，具有正常发育为成熟胚囊的雌配子体较少。而泰安地区甜樱桃雌配子体胚囊发育正常的占大多数，少数为有胚珠无胚囊或无胚珠类型。

图2 杭州地区甜樱桃雌配子体的异常发育类型Fig.2 Abnormal development types of female gametophyte of sweet cherries in Hangzhou area

2.3 杭州和泰安地区甜樱桃花器官发育质量比较

由表3可知：2017年杭州地区品种间每个花序平均花朵数无显著差异，雄蕊长度差异显著，其中‘布鲁克斯’最短，为8.38 mm；‘萨米脱’和‘拉宾斯’在雌蕊长度、子房直径、雄蕊数间无显著差异。泰安地区品种间子房直径无显著差异，雌蕊长度差异显著，其中‘萨米脱’最短，为11.61 mm；‘萨米脱’和‘布鲁克斯’在每个花序平均花朵数和雄蕊数间均无显著差异。相同品种花器官大小在两地存在一定的差异：泰安地区‘萨米脱’雄蕊长度和雄蕊数均大于杭州地区；‘布鲁克斯’每个花序平均花朵数和雄蕊数在两地间无显著差异，其雄蕊长度在泰安地区大于杭州地区，而雌蕊长度和子房直径恰好相反；‘拉宾斯’雄蕊长度和雄蕊数在两地间无显著差异，而其雌蕊长度在泰安地区大于杭州地区，每个花序平均花朵数和子房直径则分别为泰安地区少于和小于杭州地区。

表3 2017年度杭州和泰安地区3个甜樱桃品种花器官发育质量调查Table 3 Investigation on floral organ quality of three sweet cherry cultivars in Hangzhou and Tai'an areas in 2017

由表4可知：2018年不同地区相同品种间差异表现在‘萨米脱’除雄蕊数外其余参数在两地间无显著差异，‘布鲁克斯’雄蕊长度和子房直径在两地间差异显著，‘拉宾斯’雌蕊长度和子房直径在两地间差异显著。在子房直径方面，泰安地区3个品种均显著小于杭州地区，但2018年均大于2017年。

表4 2018年度杭州和泰安地区3个甜樱桃品种花器官发育质量调查Table 4 Investigation on floral organ quality of three sweet cherry cultivars in Hangzhou and Tai'an areas in 2018

由两地各品种双雌蕊率统计结果（表3～4）可知：2017年杭州地区‘拉宾斯’双雌蕊率最高，为23.97%，‘布鲁克斯’最低，为16.67%，而泰安地区‘拉宾斯’为9.09%，‘布鲁克斯’为0。2018年杭州地区‘拉宾斯’双雌蕊率最高，为43.14%，而在泰安地区其双雌蕊率仅为4.00%，其余品种在不同地区间双雌蕊率也不同：杭州‘萨米脱’为3.64%，而在泰安未观察到双雌蕊现象；杭州‘布鲁克斯’为12.00%，而泰安为6.67%。

此外，田间试验观察发现：杭州地区甜樱桃雄蕊雌蕊化比例较高，为3%～9%。雌蕊则表现为多种异常发育类型：在现蕾期可见雌蕊伸出花苞；雌蕊无花柱，子房退化；雌蕊花柱极短且无柱头；多雌蕊等（图3）。以上现象在泰安地区调查中暂未发现。

图3 杭州地区甜樱桃花期异常观察Fig.3 Abnormal development during flowering stage of sweet cherries in Hangzhou area

2.4 杭州和泰安地区甜樱桃花粉质量比较

从表5可以看出：2017年度杭州地区3个甜樱桃品种的花粉活力和花粉量无显著差异，但‘萨米脱’花粉萌发率显著较低；泰安地区品种间花粉量差异不显著，而‘萨米脱’的花粉活力和萌发率显著低于另2个品种。两地间的差异表现为，杭州地区甜樱桃花粉活力和萌发率均高于泰安地区，而花粉量则前者较低。杭州地区花粉量较低，显然与其雄配子体发育过程中空花粉囊比例较高相吻合，表明雄配子体发育异常会直接影响花期花粉量。

2018年度的结果（表6）表明：杭州地区‘萨米脱’除花粉活力外，花粉量和萌发率均显著低于泰安地区；杭州地区‘布鲁克斯’花粉质量3个参数的值均低于泰安地区，其中花粉活力和花粉量显著低于后者；杭州地区‘拉宾斯’花粉质量3个参数的值亦低于泰安地区，其中花粉量和萌发率与后者差异显著。可见，杭州地区甜樱桃花粉的整体质量较差。

2.5 杭州和泰安地区甜樱桃开花坐果期温度比较

图4～5为杭州、泰安两地区2017、2018年甜樱桃花芽萌动前1周至盛花期的最高与最低温度。2017年在此段时期内杭州地区最高温超过20℃的时间为12 d，泰安为8 d；2018年此期间泰安地区最高温度变化曲线与杭州地区较为贴合，两地最高温度相差不大：杭州地区最高温超过20℃的时间为16 d，泰安为14 d。进一步统计开花期温度可知，2017年杭州地区（3月31日—4月8日）最高温为27℃，超过20℃的有7 d，泰安地区（4月2—8日）最高温为24℃，超过20℃的有4 d。2018年，杭州地区（3月26—30日）最高温为27℃，超过20℃的有5 d，泰安地区（3月28—31日）最高温为29℃，高于杭州地区，超过20℃的有4 d。

另外，对杭州地区甜樱桃休眠期（12月—翌年2月底）通过0～7.2℃模型计算，结果表明：2016—2017年杭州地区3个月的低温累积量为1 033 h，2017—2018年可达1 108 h。

3 讨论

胚胎学研究已表明，种子败育主要表现在：雌雄配子体的不育性、自交或异交的不亲和造成的授粉受精不良、胚中途败育[10]。其中，雌雄配子体的正常发育是形成种子与坐果的首要条件，因此，在果树生产中对花而不实、坐果率低的研究多集中在各个树种和品种雌雄配子体的发育特征方面。本研究中，杭州地区甜樱桃雄配子体在发育过程中出现较高比例的空花粉囊，造成杭州地区花粉量较少；在二核细胞阶段观察到有退化、降解及多种发育异常的类型，造成后期雄配子体的败育。此外，杭州地区甜樱桃雌配子体中胚珠和胚囊的发育状况极差，存在较高比例的有胚珠无胚囊类型，以及部分珠心和珠被细胞提前解体退化。由此推断，雌雄配子体发育过程中的异常导致败育是造成杭州地区坐果率低的主要原因。这与王世平等[2]对上海地区甜樱桃子房切片的观察结果相似：上海地区甜樱桃正常发育的子房类型仅占1.8%，大部分（71.9%）为有胚珠无胚囊类型，剩余26.3%为无胚珠无胚囊类型，上海地区甜樱桃胚珠及胚囊极差的发育状况是该地区甜樱桃花而不实的原因。在其他果树品种上也曾有类似报道：盖县李雌配子体败育的特征主要表现在胚囊的发育受阻及滞后、成熟胚囊结构的异常、珠心和珠被细胞提前解体3个方面[11]。杧果胚囊在七细胞八核时期出现营养细胞的退化，造成幼胚败育等[12]。黄金梨在四分体及其分离后形成无核细胞或形成的细胞液化不能形成较硬的外壁而解体是其花粉败育的主要原因[13]。

表5 2017年度杭州和泰安地区3个甜樱桃品种花粉质量测定结果Table 5 Determination result on pollen quality of three sweet cherry cultivars in Hangzhou and Tai'an areas in 2017

表6 2018年度杭州和泰安地区3个甜樱桃品种花粉质量测定结果Table 6 Determination result on pollen quality of three sweet cherry cultivars in Hangzhou and Tai'an areas in 2018

图4 2017年度杭州和泰安地区甜樱桃花期最高温度与最低温度Fig.4 Maximum/minimum temperature during flowering stage of sweet cherries in Hangzhou and Tai'an areas in 2017

图5 2018年度杭州和泰安地区甜樱桃花期最高温度与最低温度Fig.5 Maximum/minimum temperature during flowering stage of sweet cherries in Hangzhou and Tai'an areas in 2018

花器官发育质量和花粉质量直接影响坐果率。在杭州地区田间试验中观察到的甜樱桃柱头外露现象在果树中较少提及，在生产中一般认为有利于授粉。本研究认为，柱头外露在杭州地区不一定能提高产量，反而会使柱头受到冷空气影响，导致授粉能力降低或因冻伤直接败育，以致坐果率进一步降低。少部分雌蕊无花柱、子房退化、极短花柱或无柱头等异常发育类型均属于雌蕊败育，无法授粉坐果。同时，在试验中还观察到部分雄蕊雌蕊化现象。此类异常现象在泰安地区暂未观察到。本研究中观察到的花器官异常现象及花粉质量测定结果均表明杭州地区甜樱桃花器官发育质量较差。

通常认为，冬季低温不足是温暖地区甜樱桃花器官尤其是胚珠胚囊发育不良、坐果率低的主要原因[5]。在本试验中杭州地区甜樱桃休眠期内（12月—翌年2月底）低温累积量分别为1 033 h（2016—2017年）和1 108 h（2017—2018年）。为使需冷量表达更客观和准确，使用区间方式[14-15]划分本试验中选用的3个甜樱桃品种的需冷量，分别为：‘拉宾斯’200～400 h，‘布鲁克斯’600～800 h，‘萨米脱’＞1 200 h。由此可知，除‘萨米脱’需冷量未满足要求外，其余2个品种的低温需求均能得到满足。说明需冷量不足并不是杭州地区甜樱桃坐果率低的主要原因。

对于造成雌雄蕊败育的原因，前人的大量研究集中在温度对它的影响方面[16-18]。高温对雄配子体的影响则主要表现为对绒毡层的影响。绒毡层作为小孢子正常发育的营养供体，与小孢子的发育存在着同步协调性[19-20]。李燕等[21]指出，高温虽对花器外观造成损伤如雌蕊干枯变褐，但对胚珠和胚囊发育的影响并不明显，可能与高温处理时期及时长有关。在本研究中，对两地花芽萌动至盛花期间温度统计可知，两地在此期间内最高温差异不明显，且在2017和2018年杭州地区雌雄配子体发育正值二核细胞向成熟花粉粒转化和胚囊发育时期，本地区均温度骤降，不存在遭受高温影响现象，因此推断，温度并不是直接导致杭州地区甜樱桃雌雄配子体败育率高的因素。温度是影响植物花芽发育、雌雄配子体质量最重要的环境因素之一，其对花芽营养物质、内源激素水平等方面的影响有待于进一步研究。

4 结论

在杭州地区甜樱桃花器官发育过程中观察到雄配子体中较高比例的空花粉囊，造成花粉量较少，且花粉发育过程中的退化、降解以及多种发育异常类型造成后期雄配子体的败育；雌配子体发育成有胚珠无胚囊类型的比例较高，造成雌配子体的败育。杭州地区甜樱桃花粉质量较低，田间观察可见多种雌雄蕊发育异常类型。由此可见，杭州地区甜樱桃花器官整体发育质量较差，雌雄配子体发育异常是该地区甜樱桃坐果率低、结实困难的主要原因，但引起其发育异常的生理机制需进一步研究。