穿山龙米曲霉固体发酵物总皂苷的抗肿瘤活性研究

陈航宇 ，刘 鹤，娄婷婷，何 蕊，贺丹彤，刘 睿，位 鸿*

（1.长春中医药大学附属医院，长春 130021；2.长春中医药大学，长春 130117）

穿山龙是我国传统的中药材，主要含有多种甾体皂苷类成分，有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等药理作用[1]，文献报导从穿山龙中分离的甲基原薯蓣皂苷，具有很强的抗癌活性，是一个开发前景良好的抗癌新药侯选化合物。

现代发酵技术是在传统发酵技术的基础上结合现代生物技术发展起来的新型技术手段。应用现代生物发酵技术在适当的温度、湿度、水分等条件下对药物进行发酵，微生物产生的酶，可以使中药中的化学成分的结构得到修饰，改变其原有的特性，增强或产生新的药效，扩大应用范围，以满足临床用药[2]。

本实验的前期工作，以梗孢科曲霉属真菌米曲霉（Aspergillus oryzae）为菌种，采用固体发酵技术，对穿山龙药材进行发酵研究，经检测，发酵产物中产生了新的呋甾皂苷，本实验将穿山龙药材以及发酵产物进行提取和纯化，制成了总皂苷提取物，通过体外细胞实验，对其抗肿瘤活性及其机制进行研究。

1 材料、试剂及仪器

1.1 主要材料 原材料：穿山龙药材总皂苷（实验室自制；紫外分光光度法检测含量为128.72 mg/g）10 g；穿山龙米曲霉发酵物总皂苷（实验室自制；紫外分光光度法检测含量为133.67 mg/g）10 g。

1.2 试剂 MTT 购自Thiazoly 公司；BCA 试剂盒购于碧云天生物制剂公司；Bcl-2、Bax、caspase3、Tublin抗体购于Abcam 公司。

1.3 主要仪器 BT125D 电子分析天平为赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；流式细胞仪（型号Fascs Aria Ⅱ）购于美国BD 公司；酶联免疫检测仪（型号Infinit 200 pro）购于瑞士TEC 公司。

1.4 细胞株 人肝肿瘤细胞（HepG2）细胞株，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

2 方法

2.1 穿山龙皂苷的提取

2.1.1 提取方法 通过前期单因素实验结果以及综合文献[3]，确定了提取穿山龙中皂苷的方法为8 倍量70%乙醇回流提取，每次2 h。

2.1.2 提取工艺 分别称取穿山龙药材以及穿山龙米曲霉固体发酵产物100 g，按照2.1.1 项下提取方法进行提取，浓缩至适宜浓度备用。

2.2 穿山龙总皂苷的纯化 取穿山龙药材以及穿山龙米曲霉固体发酵物皂苷提取液用D101 大孔树脂纯化[4]，用75%乙醇洗脱至洗脱液无色，收集洗脱液，减压浓缩蒸干备用。

2.3 抗肿瘤活性研究

2.3.1 MTT 实验 将HepG2 细胞接种于96 孔培养板，每组细胞3 复孔，置于恒温恒湿培养箱培养24 h 后，每孔分别加入浓度为3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL穿山龙总皂苷溶液（穿山龙）和穿山龙米曲霉发酵物总皂苷溶液（发酵物）培养，24 h 后每孔加入10 μL MTT，4 h 后吸去培养基，每孔加入150 μL DMSO，震荡混匀30 s，使结晶完全溶解，用酶联免疫检测仪于490 nm 波长处测定其吸光度（A）值。对照组细胞存活率设为100%，计算其余各组细胞存活率，细胞存活率=（实验组平均A 值/对照组平均A 值）×100%。

2.3.2 Annexin V/PI 双染法 将对数期HepG2 细胞胰酶消化后收集，计数，用完全培养基重悬后，接种于6 孔板。置于恒温恒湿培养箱培养24 h 后，向每孔分别加入浓度为3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL 穿山龙总皂苷溶液和穿山龙米曲霉发酵物总皂苷溶液培养24 h，然后收集细胞重悬于PBS洗涤两次。用50 μL Annexin V 结合液悬浮细胞，在细胞悬浮液中加入3 μL Annexin V-FITC 染色液，轻轻混匀后室温避光孵育15 min，加入6 μL PI 染色液后轻轻混匀室温避光孵育5 min。加入450 μL Annexin V 结合液，终止染色并立即用流式细胞仪检测，用于检测细胞凋亡情况。

2.3.3 Western blotting 各组细胞药物作用24 h 后，用胰酶消化收集细胞，在RIPA 缓冲液中超声裂解，然后在4℃、10 000 r 下离心15 min，然后用BCA试剂来测定蛋白质浓度。等量的蛋白通过12%的SDS-PAGE 分离并转移到PVDF 膜上，用5%的脱脂牛奶阻断1 h 后，加入合适浓度的一抗4℃过夜，一抗分别为Bcl-2、Bax、Caspase3 和内参Tublin，TBST 洗3 次。然后再与标记有辣根过氧化物酶的二抗室温孵育1 h，TBST 洗3 次，ECL 显影。利用化学发光系统进行图像采集及蛋白灰度定量。蛋白表达水平=每个样本条带灰度值/Tublin 灰度值。用于测定HepG2 细胞中Bcl-2、Bax、Caspase3 的蛋白表达情况。

3 结果

3.1 MTT 法检测结果 应用MTT 法对不同浓度的穿山龙总皂苷溶液和穿山龙米曲霉发酵物总皂苷溶液培养HepG2细胞，与空白对照组比较，进行细胞活性检测，结果见图1，由图可见，细胞存活率有所下降，且呈现剂量依赖性，即浓度越大细胞存活率越低。

3.2 Annexin V/PI 双染色结果 镜下观察，分别加入不同浓度的穿山龙总皂苷溶液和穿山龙米曲霉发酵物总皂苷溶液24 h 后，如图2 与control 组比较可以看到12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL 浓度细胞明显死亡，且死亡细胞递增。50 μg/mL 浓度细胞死亡非常严重，更多的细胞变圆，细胞贴壁状态差，悬浮于培养基。如图3 进一步根据流式细胞术图谱可以看出6.25～50 μg/mL不同浓度的穿山龙总皂苷溶液和穿山龙米曲霉发酵物总皂苷溶液均可诱导HepG2 细胞凋亡（P＜0.001），凋亡比例明显呈浓度依赖性的升高。

3.3 Western blotting 结果 通过化学发光系统图像采集及蛋白灰度定量分析，如图4，Western blotting 检测结果显示，不同浓度的穿山龙总皂苷溶液和穿山龙米曲霉发酵物总皂苷溶液处理的HepG2 细胞，与空白对照组比较，Bcl-2、Bax、Caspase3 蛋白表达水平无显著差异。

图1 各组细胞存活率比较

图3 流式细胞术图谱

图4 不同浓度的穿山龙总皂苷溶液和穿山龙米曲霉发酵物总皂苷溶液对细胞凋亡相关蛋白表达的影响

4 讨论

在本研究中，使用米曲霉对穿山龙药材进行固体发酵，采用70%乙醇回流法对药材以及发酵物总皂苷进行提取，D101 树脂纯化，制成了穿山龙总皂苷和穿山龙米曲霉发酵物总皂苷，并采用 MTT 比色法和双荧光染色法研究其体外抗肿瘤活性，探索发酵对穿山龙药材抗肿瘤活性的影响。通过体外细胞实验研究发现，二者均可诱导HepG2 细胞凋亡，凋亡比例明显呈浓度依赖性的升高，表明发酵物具有同药材相近的抗肿瘤效果，进一步通过Western blot 对HepG2 细胞蛋白表达情况进行检测，研究了其抗肿瘤机制。

Bcl-2 家族蛋白在健康和疾病之间调节着细胞生存和死亡的临界平衡[5-6]，调节线粒体通透性[7]，Bax是bcl-2 蛋白家族中一个促凋亡的成员，它们是使细胞凋亡以及癌症的治疗靶点[8]在活细胞中，bax 和bak(bax/bak)的激活直接受到bcl-2 家族成员的抑制[9]。caspase-3 则是一种主要的凋亡执行者，在大多数凋亡事件中，caspase-3 的高度表达是细胞凋亡的关键。

本研究结果表明穿山龙药材及其米曲霉发酵物对HepG2 细胞具有促进凋亡的作用，其机制可能为上调caspase-3 的表达，对其上游bax 及bcl2 的表达没有明显影响，可能药物诱导HepG2 细胞凋亡不是通过这一通路，具体的抑癌途径还需要进一步研究，本实验对有效利用中药穿山龙资源获取药用活性成分并研究其机制提供了前期科学依据。