丰富环境干预对脑梗死大鼠学习记忆功能的影响

钟真真 徐 平 蒲蜀湘

1)常德市第一人民医院，湖南 常德 41500 2)广州医科大学附属第二医院，广东 广州 510260

卒中是导致残疾的重要原因之一，根据世界卫生组织报道全球每年有1 500万人发生卒中，其中1/3死于卒中[1]，已成为我国成人死亡和致残的主要原因，每年大约有300万新发卒中病例[2-3]。缺血性脑卒中(脑梗死)是最常见卒中类型，占全部脑卒中的60%～80%，主要表现为突发言语不清、偏侧肢体活动障碍、视物模糊、头晕和口角歪斜等。我国住院患者脑梗死1个月病死率为3.3%～3.5%，3个月内死亡/致残率为34.5%～37.1%，1 a内死亡/致残率为33.4%～44.6%。病情不再发展的48 h后行康复治疗，大多数卒中患者3～6个月内肢体运动功能和日常生活能力得到显著提高，故脑梗死患者的康复日益受到重视。

丰富环境(enriched environment，EE)是指将实验动物饲养在比标准饲养条件更多身体和社会刺激的特殊环境中，通过对身体接触、探索、社交等活动，以增强运动、认知、感觉和社会交往能力。丰富环境的构建主要包括丰富的社交、认知、感觉和自发性运动，通常包括新鲜多样的玩具、较大的自由活动空间和群居动物的密切接触，相对于标准环境更具有复杂性和多样性。既往研究丰富环境能减轻脑损伤，改善脑功能，促进脑组织损伤修复，被证明具有神经保护作用，已广泛用于啮齿动物的康复训练[4]，在各种缺血性脑损伤动物中均有报道。为了进一步研究EE对脑组织损伤的修复作用，本研究通过探讨EE对脑梗死大鼠学习记忆功能的影响，为临床应用EE促进脑梗死患者康复提供理论依据。

1 材料和方法

1．1实验动物和分组8周龄，雌性，SD大鼠36只(广州省动物中心)，随机分为手术组和假手术组，每组12只。手术组为线栓SD大鼠大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery，MCAO)动物模型，假手术组行颈部组织分离和不线栓大脑中动脉，其余步骤同手术组相同。

1．2试剂及器材脑立体定位仪(深圳瑞沃德)、Morris水迷宫实验仪器(淮北正华生物仪器设备有限公司)。

1．3实验方法MCAO大鼠模型制作：选用参照 Longa线栓改良法，麻醉大鼠，无菌操作，钝性分离右侧颈总动脉(CCA)、颈内动脉(ICA)和颈外动脉(ECA)；结扎ECA和CCA近心端；颈总动脉远心端备线；剪断颈外动脉，用线栓从颈外动脉断端插入，以颈内和颈外动脉交差点为零点，向颈内动脉插入 10～11mm，将线栓固定于颈内动脉，缝合，阻断大脑中动脉所有血流来源。模型成功的标志是：(1)提尾时左前肢内收屈曲；(2)爬行时向左侧转圈；(3)同侧Homer征。造模 24 h 行为障碍评分-Longa 评分法：评分≥ 2分的动物符合大鼠脑缺血动物模型，随即分为标准环境组和丰富环境组，每组12只。

1．4Morris水迷宫实验水迷宫系统(由圆型水池(30 cm×50 cm×120 cm)和自动录像记录系统及水迷宫图像采集、分析软件三部分组成。池中水温保持在(26±1)℃；池壁标明4个入水点，将水池平分为4个象限，任选一象限在中央放置平台，平台无色透明，高29 cm，直径12 cm，没于水下1 cm，与圆心和池壁等距。各组实验鼠分别在术后24 h予以环境干预7 d、21 d和28 d后训练定位航行实验和空间探索实验，于第5天行水迷宫评估。

1．5动物环境模型EE组鼠笼规格为100 cm×60 cm×50 cm，共有3层，每层通过楼梯相连接。老鼠可通过楼梯进入另一层。笼中放有转轮、管道、秋千和积木，积木每3天跟换一次，笼中大鼠可自由进食。EE中每笼12只大鼠共同饲养。标准环境(standard environment，SE)组鼠笼为常规半透明有机玻璃(25 cm×20 cm×20 cm)笼内仅提供食物和水，每笼6只大鼠共同饲养。大鼠造模成功后随机分配置于丰富环境笼和标准环境笼中，饲养4周。

2 结果

2．1各组大鼠潜伏期比较定位航行实验中，EE组和SE组在第7、21和28天后的潜伏期均长与相应时间点的假手术组，差异具有统计学意义(P<0.05)；EE组在第28天的潜伏期明显短于标准环境组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

组别n7 d21 d28 d假手术组(s)1234.75±9.2733.31±9.2329.71±6.34SE组(s)1265.01±33.46*61.52±22.39*63.39±23.08*EE组(s)1257.04±33.78*54.11±29.96*44.14±21.39*△

注：与假手术组比较，*P<0.05；与标准环境组比较，△P<0.05

2．2各组大鼠穿越平台距离比较空间探索实验中，EE组和SE组第7、21和28天后的穿越平台距离与相应时间点的假手术组明显短，差异具有统计学意义(P<0.05)；EE组第21天和28天穿越平台距离明显长于SE组的相应时间点(P<0.05)。见表2。

2．3各组大鼠穿越平台距离占游泳总距离的百分比的比较在空间探索实验中，EE组和SE组第7、21和28天后的穿越平台距离占游泳总距离的百分比小于相应时间点的假手术组(P<0.05)；EE组第28天穿越平台距离占游泳总距离的百分比明显高于相应时间点的SE组(P<0.05)。见表3。

表2 各组大鼠穿越平台距离比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与标准环境组比较，△P<0.05

组别n10 d20 d30 d假手术组121.06±0.321.14±0.311.21±0.33SE组120.70±0.14*0.75±0.17*0.85±0.12*EE组120.77±0.15*0.91±0.16*0.98±0.17*△

注：与假手术组比较，*P<0.05；与标准环境组比较，△P<0.05

2．4各组大鼠穿越平台次数比较空间探索实验中，EE组第7、21天和SE组第7、21、28天穿越平台次数比相应时间点的假手术组少，差异具有统计学意义(P<0.05)；EE组第21天和28天后穿越平台数明显多于相应时间点SE组，差异具有统计学意(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠穿越平台次数比较

注：与假手术组比较，*P<0.05；与标准环境组比较，△P<0.05

2．5各组大鼠环境干预第28天穿越平台的轨迹A为SE组，B为EE组，C为假手术组。

图1 各组大鼠环境干预第28天穿越平台的轨迹Figure1 Trajectory crossing platform of rats in each group on day 28 of environmental intervention

3 讨论

环境对神经系统、行为和生理活动的重要性一直得到社会学、生物学和临床医学的认可。既往研究报道，经验和环境条件能影响脑梗死的进展和症状。丰富环境是指动物的居住环境，无论从笼舍大小还是笼舍置物相对于标准环境都有利于增加动物的感官刺激、运动、认知及相互交往的社会机会。已有很多研究报道EE可使神经元树突变长，树突棘增多，突触和突触小结变大[5]。在行为学上，EE提高老鼠空间任务的执行力，增加海马功能的复杂性和情绪化，缓解老年动物记忆力下降，提高空间探索活动、学习和记忆能力[6-8]。在几种神经系统退行性疾病的动物模型中，EE能促进营养因子的表达和修复星性胶质细胞，以发挥神经保护作用。大量实验证明，在精神分裂、肌萎缩侧索硬化、癫痫、卒中、亨廷顿氏病和阿尔茨海默病的动物模型中，EE都有益于其疾病的恢复[9]。SCHREIBER 等[10]研究发现中度创伤性脑损害老鼠在丰富环境下，其行为测试上得到一个很好的恢复。EE能加速中枢神经系统的发育，重新开启成年人皮质层神经元的可塑性[11]，使学习和记忆得到一定的改善[12]，尤其是在老年动物或是神经系统退性型疾病模型中。

Morris水迷宫测试程序主要包括空间探索和定位航行两部分组成，已被认为是评估空间学习和记忆的一种实验方法。被动迫使动物游泳，使其寻找水迷宫隐蔽的平台，通过计算机分析其寻找平台所用时间及跨越平台的次数、轨迹和穿越平台距离占游泳总距离的百分比等测试实验动物对空间定位的学习和记忆能力，进而判断实验动物的记忆功能。现已用于学习记忆、阿尔茨海默病和智力/衰老等疾病的研究。本研究结果显示，通过对脑梗死大鼠不同环境的干预后，发现EE组大鼠在潜伏期、穿越平台距离、穿越平台距离占游泳总距离的百分比和穿越平台次数较SE明显改善，说明EE能能改善脑梗死大鼠的学习记忆功能，对神经元系统存在一定的修复作用。

EE对神经元的保护机制善不清楚，可能由多种因素汇合而成，但大量的研究表明，营养因子的合成和释放可能起着至关重要的作用。EE有利于促进局灶性脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力的恢复，促进梗死周边皮质和海马齿状回区抗大鼠脑源性神经营养因子的表达，从而促进脑缺血大鼠功能的恢复[13]。另外研究发现EE可改善局灶性脑梗死大鼠的学习记忆能力，主要是通过上调胆碱乙酰转移酶的表达。YU 等[14]将脑梗死大鼠术后24 h后置于EE 14 d，发现术后第7天开始，EE组大鼠神经学行为评分明显高于SE组，EE不仅加速脑梗死大鼠在协调和组织动作的恢复还改善脑缺血后的学习和记忆表现，促进梗死区周围区域的皮质血管生成，表明EE通过调节脑组织缺血后血管的生成促进神经功能的恢复。ROSBERGEN 等[15]通过对30例卒中患者行前瞻性非随机性研究，卒中24～72 h内行EE环境干预，发现可以提高卒中患者的生存率和幸存者的生活水平，降低精神疾病的发生[16]。BONACCORSI 等[17]研究表明EE不仅能加速额叶前皮质层部信息收集同时还能恢复与空间记忆相关的皮质层区域。LEGER等[18]也同样发现无论EE对动物模型干预1～6周，EE都能改善其认知记忆功能，认为环境干预3～5周可促进尚存神经的表达，尤其是3周EE干预可提高额叶皮质部血清素浓度。

EE环境虽然不完全具有可比性，但与标准环境组更接近动物的自然生存环从而增加动物的自发性活动和反应性[19-21]。本实验结果显示，将实验性脑梗死大鼠饲养在EE和SE中，其行为学结果在环境干预后21～28 d后组，在学习和记忆方面EE组大鼠明显优于SE组，提示丰富环境可改善脑梗死大鼠学习记忆功能。