Hcy通过P38/MAPK 介导MCP-1表达与颈动脉硬化的机制

马进军 张家祥 李结华

(安徽医科大学 1第一附属医院干部心血管内科，安徽 合肥 230032；2公共卫生学院)

动脉粥样硬化(AS)是心脑血管的重要危险因素之一，早发现、早诊断、早期干预显得尤为重要。同型半胱氨酸(Hcy)是蛋氨酸的中间代谢产物，在体内主要通过甲基化途径和转硫途径代谢，研究发现高Hcy血症与颈动脉内-中膜厚度(IMT)和颈动脉狭窄呈正相关，是颈动脉硬化的独立危险因素之一〔1〕。颈动脉因位置表浅、检测方便无创被作为动脉硬化评估的指标。Hcy与AS的机制复杂，可能与氧化应激、内皮细胞功能障碍、细胞炎性因子等导致内皮细胞增殖有关〔2〕。单核细胞趋化蛋白(MCP)-1是促炎性因子，促进单核-巨噬细胞的迁移和组织浸润，参与动脉硬化的形成和发展。本研究分析Hcy和颈AS的关系，同时通过体外培养人脐静脉内皮细胞，检测MCP-1的含量，探讨Hcy引起动脉硬化的机制。

1 材料与方法

1.1研究对象与方法 纳入2016～2017年安徽省直医院住院的226例缺血性脑卒中患者，根据颈动脉超声检查结果分为颈动脉内膜正常组(91例)，内膜增厚组(24例)，斑块组(100例)和狭窄组(11例)。纳入标准：①年龄60～90周岁；②入院后完善血生化检查和颈动脉彩超检查；③无颈动脉支架或内膜剥脱术史；④病例资料完整。排除标准：①近期使用影响Hcy的药物如B族维生素，甲氨蝶呤等；②甲状腺功能异常；③肝肾功能异常；④认知障碍、不能配合检查者。细胞培养实验：原代培养的人脐静脉内皮细胞，p38抗体、磷酸化p38抗体购自美国Santa cruz Biotechnology公司，MCP-1抗体购自美国Sigma公司。

1.2主要仪器 全自动生化分析仪，电泳仪DYY-10(Ecp3000 北京六一仪器厂)，TGL-18R冷冻离心机(珠海黑马仪器厂)。

1.3Hcy水平测定 所有患者空腹12 h以上，晨起用生化管抽取静脉血5 ml，迅速离心后使用全自动生化仪测量血糖、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、血尿酸(UA)、Hcy水平等指标。

1.4颈动脉超声 采用Philips Epiq7C彩色多普勒超声诊断仪，被检查者平卧，检测颈总动脉、颈动脉分叉处、颈内动脉，IMT，并观察有无斑块形成，狭窄程度及斑块性质。选取双侧颈总动脉远端及颈内动脉分叉膨大部1.0～1.5 cm血管壁，分别测量动脉前后壁内膜表面间垂直距离及管腔内膜界面为IMT，IMT<1.0 mm为正常，1.0≤IMT≤1.5 mm为IMT增厚，IMT>1.5 mm，斑块凸向管腔为斑块形成，颈动脉斑块导致管腔狭窄>50%为颈动脉狭窄。

1.5人脐静脉内皮细胞培养 培养基中加入不同浓度Hcy(0、1、10、100、1 000 μmol/L)，另将培养基分为对照组，Hcy组和Hcy+SB203580(p38通路特异性抑制剂)，实时定量聚合酶链反应(PCR)测定人血管内皮细胞MCP-1 mRNA水平，PCR产物(MCP-1 290 bp，GAPDH 454 bp)在1.5%的琼脂糖凝胶电泳。MCP-1上游GCTGACCCCAAGAAGGAATG、下游TGAGGTGGTTGTGGAAAAGG、GAPDH上游CGTCCCGTAGACAAAATGGT、下游TTGATGGCAACAATCTCCAC。MCP-1和GAPDH的吸光度比值为mRNA的相对表达量。

1.6实时定量PCR检测 提取人静脉内皮细胞RNA，按照试剂盒操作步骤转录为cDNA，使用SYBR Green 燃料在实时定量PCR仪上进行上机检测。

1.7Western印迹检测 放射免疫沉淀(RIPA)缓冲液提取人静脉内皮细胞总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法测定总蛋白浓度，质量相等的蛋白提取物经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)后转移到硝化纤维素膜上进行蛋白印迹分析，以GAPDH作为内参。

1.8统计学处理 采用SPSS23.0软件进行单因素方差分析、χ2检验及Logistic回归分析。

2 结 果

2.1各组一般资料比较 各组年龄、性别、高血压者比例、糖尿病者比例、体重指数(BMI)、TC、TG、LDL-C和血UA水平差异均无统计学意义(均P>0.05)；狭窄组HDL-C水平与内膜正常组差异有统计学意义；与内膜正常组相比，内膜增厚组、斑块组及狭窄组Hcy水平明显升高(P<0.05)，随着IMT增加，血Hcy水平依次增加，见表1。

表1 各组一般资料分析

2.2颈动脉硬化程度影响因素 以颈动脉硬化分组为因变量，以Hcy水平为自变量，进行多因素Logistic回归分析，发现Hcy水平是内膜增厚、斑块和狭窄的危险因素(P均<0.05)，见表2。

表2 颈动脉硬化程度影响因素Logistic回归分析

因变量赋值，颈动脉硬化程度：正常=0，内膜增厚=1，斑块=2，狭窄=3；自变量赋值，Hcy水平正常=0，增高=1

2.3不同浓度Hcy处理人脐静脉内皮细胞MCP-1 mRNA表达 随着Hcy剂量增加，MCP-1基因表达水平不断升高(0、1、10、100、1 000 μmol/L Hcy处理MCP-1 mRNA表达分别为1.00±0.06、1.09±0.44、2.01±0.23、3.19±0.27、3.88±0.30)。

2.4Hcy处理人脐静脉内皮细胞p38蛋白表达 与对照组(1.00±0.09)比较，Hcy组磷酸化p38水平(3.30±0.34)明显升高，Hcy+SB203580组表达水平(1.82±0.38)显著降低(P<0.05)，见图1。

图1 各组人脐静脉内皮细胞p38蛋白表达

2.5使用SB203580后Hcy处理人脐静脉内皮细胞MCP-1表达 与对照组(1.00±0.88、1.00±0.14)比较，Hcy组MCP-1 mRNA和蛋白(2.89±0.28、4.00±0.35)水平明显升高，Hcy+SB203580组MCP-1 mRNA和蛋白水平(1.44±0.11、1.90±0.19)均显著降低(P<0.05)，见图2。

图2 各组人脐静脉内皮细胞MCP-1蛋白表达

3 讨 论

AS是多数心血管疾病的病理学基础，冠心病、缺血性脑血管性疾病等一旦出现难以逆转的AS终末期病变，患者远期死亡率将极大增加〔3〕。因此监测和控制亚临床阶段的AS就显得尤为重要，颈动脉IMT(CIMT)测定是一种简便、无创的利用超声监测颈动脉壁的技术，它常被认为是早期AS的替代指标，被广泛用于临床筛查〔4〕。Hcy是一种含巯基氨基酸，来源于饮食中必需氨基酸甲硫氨酸的中间代谢产物。血清Hcy水平升高为心血管疾病的独立危险因素，其水平与性别、年龄、叶酸水平、肾功能等因素有相关性。本研究发现Hcy水平与CIMT或颈动脉狭窄程度呈正相关，结果与前期研究结果一致〔5〕。同时，Hcy水平是颈动脉硬化的主要危险因素之一。

颈动脉硬化斑块中含有大量炎性细胞浸润，血管积聚大量的单核细胞和淋巴细胞，因此有研究提出AS病变的形成实际上是对内膜损伤做出的一系列炎症反应，炎症反应在AS的发生发展过程中发挥重要作用〔6,7〕。AS作为一种慢性炎症疾病，内皮细胞受损后诱导炎性因子释放是AS发生主要起始原因之一。前期研究〔8,9〕发现在动脉粥样硬化斑块中检测到MCP-1等趋化因子含量的升高。MCP-1可诱导表达于内皮细胞、平滑肌细胞和单核细胞，不仅具有趋化单核细胞移动的功能，而且对血管内皮细胞黏附分子的表达具有调节作用，因而，在趋化吸引及调节单核细胞黏附和跨内皮迁移的过程中具有十分重要的作用〔10〕；另外，MCP-1 是细胞内与胆固醇的转运及代谢过程密切相关的生物大分子，也参与了AS的病理过程〔11〕，本研究发现Hcy处理可增加人脐静脉内皮细胞MCP-1水平，进一步论证了Hcy与MCP-1的关系。

丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，广泛存在于哺乳动物细胞内，将细胞外信号转导到细胞内引起细胞生物学反应〔12〕，p38MAPK是MAPK信号转导通路的主要组成部分之一，在体内调控多种促炎因子的表达，同时在血管内皮细胞损伤中具有重要作用〔13〕。多数研究认为动脉粥样硬化是炎症驱动的过程，因此p38 MAPK的研究备受关注，有研究发现研究显示，磷酸化p38 MAPK在大鼠AS斑块组织中过度磷酸化，并且在血管内皮细胞中发现有p38 MAPK的表达〔14〕，磷酸化p38 MAPK通路可以促进MCP-1的大量表达，是其产生的关键上游分子〔15〕，本次实验使用Hcy处理人脐静脉内皮细胞发现，磷酸化p38的表达量明显升高，使用SB203058，一种p38 MAPK特异性抑制剂，发现磷酸化p38的表达明显降低；同时，使用SB203580后，Hcy处理人脐静脉内皮细胞MCP-1表达水平明显降低，表明p38 MAPK通路在Hcy介导MCP-1表达的作用机制。

本研究发现，血清Hcy浓度是CIMT增厚的主要原因之一，Hcy处理后MCP-1水平在AS发生发展中发挥重要作用；然而，本实验样本量有限，且未能得到人群MCP-1水平，在后期研究中需要加大样本量并对其机制进行深入探讨。