加味涤痰汤对脑缺血再灌注损伤大鼠脑细胞自噬的特异性

陈维达 刘晓婷 陈泽涛

(1山东中医药大学，山东 济南 250355；2山东中医药大学附属医院；3潍坊市中医院)

缺血性脑卒中是脑血管病最常见的一种类型，占全部脑卒中的60%～80%〔1〕，中医方面又称“中风”。它导致的神经功能障碍常对患者的生活质量造成严重影响，且发病率、致残率、复发率极高。涤痰汤出自《济生方》,有益气祛痰、化浊开窍的功能，是治疗急性期缺血性脑卒中的有效方剂。刘晓婷等〔2〕研究发现，加味涤痰汤灌胃对缺血再灌注(CIR)损伤大鼠神经功能有保护作用，但并未详细探讨涤痰汤对CIR损伤关于自噬方面的具体机制。已有研究表明〔3〕，自噬在CIR损伤中具有重要作用。自噬不仅参与细胞死亡，同时也是细胞在恶劣环境中维持自我内环境稳定的一种保护机制。本文通过对大鼠进行右侧大脑中动脉栓塞(MCAO)构建CIR模型，探讨加味涤痰汤对CIR损伤大鼠脑细胞自噬的影响。

1 材料与方法

1.1材料 2016年2月至2017年2月选取SPF级雄性SD大鼠90只(北京维通利华实验动物技术有限公司提供)，体重140～160 g。加味涤痰汤方药组成：胆南星 12 g、石菖蒲10 g、橘红10 g、栀子10 g、枳实10 g，半夏9 g，水蛭6 g、生大黄6 g；采用北京康仁堂药业全成分中药配方颗粒，每剂 9.6 g。吡拉西坦片(山东仁和堂药业有限公司生产，批号 20160122，剂量：0.4 g/片)。Western印迹主要试剂见表1。

1.2构建CIR损伤模型 术前禁食、禁水6 h。以10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉大鼠，麻醉满意后，参照Clark等〔4〕的方法，对大鼠进行可逆性MCAO线栓法栓塞右侧大脑中动脉，缝合皮肤切口。术中以加热板保持大鼠肛温在37℃左右。假手术组除不插入线栓外余手术过程相同。缺血90 min后拔出栓线进行CIR，90 min 后参照Longa等〔5〕制定的标准对大鼠进行神经功能障碍评分。本实验选用神经功能评分为1～3分进行右侧MCAO成功的大鼠和0分的假手术大鼠。

表1 Western印迹主要试剂

LC3-Ⅱ:自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链Ⅱ

1.3实验分组 实验共分为5组：假手术组随机纳入假手术大鼠5只；模型组、中药高剂量组、中药低剂量组、西药组各随机纳入造模成功的CIR损伤的大鼠各5只。

1.4方法 于造模成功后24 h给药，1次/d，连续给药7 d，中药高剂量组给予加味涤痰汤0.768 g/(kg·d)，中药低剂量组给予加味涤痰汤0.384 g/(kg·d)，西药组给予吡拉西坦片0.1 g/(kg·d)，假手术组与模型组给予等量的生理盐水，灌胃容积为10 ml/kg。于给药周期结束24 h内，每组取5只大鼠采用Western印迹测定脑组织中LC3-Ⅱ、Beclin1、Bcl-2的表达。

1.5统计学方法 采用SPSS20.0统计软件进行单因素方差分析、LSD-t法。

2 结 果

2.1用药后各组脑组织LC3-Ⅱ、Beclin 1、Bcl-2的表达 与假手术组比较，模型组缺血脑组织中LC3-Ⅱ、Beclin 1、Bcl-2表达显著升高(P<0.05)。与模型组比较，中药高剂量组、低剂量组及西药组LC3-Ⅱ、Bcl-2表达均显著降低(P<0.05)。中药高剂量组及西药组Beclin1表达显著下降(P<0.05)，见图1、表2。

1～5：假手术组、模型组、中药高剂量组、中药低剂量组、西药组图1 用药后各组脑组织LC3-Ⅱ的表达

表2 各组Bcl-2、Beclin1、LC3-Ⅱ表达比较

与假手术组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

3 讨 论

涤痰汤是脑卒中急性期治疗的传统方剂，具有涤痰开窍之功效。近年来，在缺血CIR动物模型与体外细胞培养等方面的研究进一步明确了涤痰汤药理作用的机制。张勇等〔6〕将CIR损伤大鼠MCAO随机分组，结果显示术后72 h涤痰汤组较模型组神经功能缺损程度显著改善，脑组织受损程度明显减轻。刘玲等〔7〕用同样的方法进行研究，发现术后72 h涤痰汤组缺血侧脑组织细胞凋亡率明显降低，表明涤痰汤的神经保护作用可能与抑制缺血后细胞凋亡有关。本研究采用的加味涤痰汤是在涤痰汤基础上化裁而来，治疗脑卒中急性期痰瘀互结、化热动风者。

自噬是真核细胞利用溶酶体对衰老、过剩的生物大分子(如蛋白质)及受损的细胞器进行分解代谢的过程〔8〕。既往研究证明〔9〕，缺血缺氧是自噬激活的重要诱因之一。自噬过程由一系列自噬相关蛋白(Atg蛋白)介导完成，LC3是自噬体膜上的标记蛋白。LC3-Ⅱ被用来作为自噬体的标记，其水平在某种程度上反映了自噬体的数量〔10〕。本研究结果表明，在缺血CIR发生发展的病理过程中自噬机制参与其中，且自噬是被激活的，这与既往研究结果相同〔9〕。另外，LC3-Ⅱ表达的降低反映出自噬受到抑制。因此，CIR发生后自噬加剧缺血后的脑损伤；加味涤痰汤能减轻CIR后的脑损伤，其机制与抑制CIR损伤后发生的自噬有关。

Beclin1基因是哺乳动物参与自噬的特异性基因，是形成自噬体的必需分子，在一定程度上可代表自噬的活性，能够调节自噬体膜合成和物质转运。Bcl-2家族是一组结构域的高度同源蛋白系列，在细胞凋亡中起重要调节作用。Bcl-2作为经典的抗凋亡蛋白，在调控细胞自噬的过程中也有重要作用。此外，Bcl-2还能通过多种机制调控氧化应激，而氧化应激在诱导自噬和凋亡中均发挥作用〔11,12〕。当细胞内环境稳定时，Beclin1与Bcl-2家族蛋白持续结合，并抑制自噬的发生。Bcl-2蛋白能阻止Beclin1蛋白与调控因子Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(PI3KC3)特异性结合，或减少PI3KC3磷酸化活性而起到抑制自噬的作用。当细胞发生饥饿或应用自噬诱导剂使自噬增强时，继而发生Beclin1与Bcl-2的解聚〔13〕，使Beclin1依赖的自噬增加，提示Bcl-2对自噬起抑制作用。由此可见，自噬与凋亡之间存在复杂的调控关系，而Beclin1与Bcl-2的平衡状态则是调控自噬与凋亡互反馈作用的关键因素。

本研究结果说明，在缺血缺氧条件下，机体通过上调Beclin1的表达来诱导自噬的激活；同时，Bcl-2表达的升高表明抗凋亡作用的增强。目前普遍认为自噬和凋亡在特定情况下可以相互转化，共同促进细胞死亡。自噬抑制凋亡的主要机制是线粒体自噬，线粒体受损时细胞内的自噬激活因子会被激活，使细胞启动自噬来挽救细胞，自噬就会对受损的线粒体进行捕捉并将其降解消除，以防止细胞发生凋亡〔14〕。本研究表明，中药高剂量组能有效抑制自噬；且高剂量组优于低剂量组，表明存在量效关系，高剂量能更有效抑制自噬的发生。

综上，加味涤痰汤能通过干预脑缺血CIR损伤后的自噬，调节自噬活性，抑制LC3-Ⅱ、Beclin1的表达，有效下调自噬，起到缺血CIR后神经保护的作用。但自噬发生的机制及调节通路十分复杂，本文仅就加味涤痰汤对自噬的影响做了研究，至于其发挥神经保护的分子机制、确切的调节通路及如何调控自噬与凋亡的发生等问题，有待进一步研究。