IGF-1经AKT通路对人肺癌A549细胞增殖、侵袭与转移的影响

刘思嘉 刘析璘 黄婷 兰蕙 叶丽平,2

(锦州医科大学 1病理生理学教研室，辽宁 锦州 121001；2生物人类学研究所)

肺癌由于临床症状隐匿，肿瘤细胞易通过直接扩散、血行转移、淋巴道转移，因此侵袭与转移是肺癌患者死亡的主要原因。对于肿瘤发生和发展机制的研究，可为提高早期诊断、寻找治疗靶点提供必要的理论依据。胰岛素生长因子(IGF)-1是一种具有促生长作用的细胞因子，可与受体结合，经多条信号通路促进细胞增殖、侵袭与转移。研究发现IGF-1与乳腺癌、肝癌、胃癌等恶性肿瘤显著相关〔1～3〕。基质金属蛋白酶(MMP)-9可降解细胞外基质和基底膜，与新生血管生成、肿瘤发生发展密切相关〔4〕。上皮型钙黏附蛋白(E-cadherin)，主要维持上皮细胞的形态和完整性，其表达下降可降低细胞之间的黏附力，促进肿瘤浸细胞侵袭与转移〔5〕。小鼠双微体扩增基因(MDM)2在多种肿瘤细胞中高表达，可促进肿瘤细胞生长〔6〕。目前，有关IGF-1调控肺癌细胞侵袭与转移的机制尚不十分清楚。本研究旨在探讨IGF-1能否经蛋白激酶B(AKT)通路调节人肺癌A549细胞MMP-9、E-cadherin和MDM2蛋白的表达及其对细胞增殖、侵袭与转移的影响。

1 材料与方法

1.1细胞 人肺癌A549细胞购自中国科学院上海细胞库。

1.2主要试剂 RPMI-1640培养基(美国Corning)；四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技)；BCA蛋白定量试剂盒；Transwell小室，基质胶(美国 BD)；结晶紫(美国Sigma)；AKT、磷酸化(p)-AKT、MMP-9、MDM2、E-cadherin、β-actin抗体(博奥森)； IGF-1(abbkine)；LY294002(MCE)。

1.3细胞培养及分组 A549细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,37℃、5%CO2常规培养传代。细胞融合至70%～80%时无血清饥饿过夜。将细胞随机分成对照组、LY294002组、IGF-1组和IGF-1+LY294002组。IGF-1及 AKT抑制剂LY294002终浓度分别200 ng/ml、20 μmol/L。每组至少重复3次，培养48 h后检测。

1.4噻唑蓝(MTT)法 将6×107/L细胞接种于96孔培养板，每孔100 μl。培养48 h后，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl 。继续培养4 h后，每孔加150 μl二甲基亚砜(DMSO)，490 nm处检测OD值，细胞增殖率=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.5划痕实验 3.0×105个细胞接种于6孔板，200 μl枪头划痕，磷酸盐缓冲液(PBS)轻洗3次，显微镜下拍照，培养48 h后再次拍照。划痕愈合率=(0 h宽度-48 h宽度)/0 h宽×100%。

1.6Transwell侵袭实验 消化细胞将细胞浓度调至5×105/ml。取100 μl 细胞悬液加入基质胶包被好的Transwell 上室中，下室加入培养基。48 h后，0.1%结晶紫继续染色15 min，洗去结晶紫，倒置显微镜下取5 个随机视野观察记录细胞数目并照相。

1.7Western印迹检测相关蛋白表达 收集处理后的细胞，液冰上裂解30 min，离心取上清。BCA蛋白定量后制成蛋白样品，十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，经3%BSA封闭后分别，加入一抗(1∶1 000)4℃过夜，加入相应二抗(1∶1 000)。电化学发光(ECL)显色试剂盒显色，Image J软件分析目的蛋白条带的灰度值。

1.8统计学方法 采用SPSS22.0统计软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1IGF-1对A549细胞增殖的影响 IGF-1组细胞增殖率明显高于对照组(P<0.01)。IGF-1+LY294002组的细胞增殖率明显低于IGF-1组(P<0.01)。见表1。

2.2IGF-1对A549细胞迁移能力的影响 IGF-1组细胞迁移率明显高于对照组(P<0.01)；与IGF-1组相比，IGF-1+LY294002组的细胞迁移率明显降低(P<0.01)，见表2，图1。

2.3IGF-1对A549细胞侵袭能力的影响 IGF-1组细胞侵袭率明显高于对照组(P<0.01)；与IGF-1组相比，IGF-1+LY294002组细胞的侵袭率显著降低(P<0.01)，见表2，图2。

表1 IGF-1对A549细胞增殖能力的影响

与对照组相比:1)P<0.01；与IGF-1组相比:2)P<0.01；下表同

表2 IGF-1对A549细胞、迁移、侵袭能力的影响

图1 IGF-1对培养不同时间A549细胞迁移能力的影响(×10)

图2 IGF-1对A549细胞侵袭能力的影响(×10)

2.4IGF-1对A549细胞相关蛋白的表达水平 与对照组相比，IGF-1组细胞MDM2、MMP-9和p-AKT的蛋白表达水平明显增高，而E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)；与IGF-1组相比，IGF-1+LY294002组细胞MDM2、p-Akt和MMP-9的蛋白表达显著降低，而E-cadherin蛋白表达增加(P<0.05)。见表3、图3。

表3 IGF-1对A549细胞MMP-9、MDM2、E-cadherin、AKT蛋白表达的影响

图3 IGF-1对A549细胞MMP-9、MDM2、E-cadherin、AKT蛋白表达的影响

3 讨 论

肿瘤的发生发展与其侵袭转移能力密切相关。近年来，IGF-1与肿瘤的关系备受关注。IGF-1在人类多种肿瘤组织中呈高表达，其通过与受体结合，调节细胞增殖、分化。相关研究表明IGF-1可通过细胞外调节蛋白激酶(ERK)、AKT等多种信号通路诱导上皮细胞向间质细胞转变(EMT)，促进肿瘤的侵袭转移〔7，8〕。本研究结果也证实IGF-1可促进肺癌A549细胞增殖、侵袭及转移，且可被AKT特异性抑制剂所阻断，提示IGF-1可能通过AKT通路参与肿瘤细胞的侵袭与转移，这与相关研究〔9,10〕结果相一致。

肿瘤细胞突破基底膜是肿瘤侵袭的标志，也是肿瘤细胞侵袭与转移的关键步骤。MMP-9是降解细胞外基质和基底膜的重要金属蛋白酶，可促进多种肿瘤细胞的侵袭与转移〔11〕。肿瘤细胞间的黏附作用也与肿瘤转移有关。作为细胞间黏附分子，低表达E-cadherin可促进肿瘤细胞的转移〔12,13〕。MMP-9和E-cadherin可相互作用，共同促进肿瘤细胞的侵袭和转移。E-cadherin可抑制肿瘤细胞产生MMP-9，下调E-cadherin可以使MMP-9的表达量增加，进而促进肿瘤细胞的侵袭与转移〔14,15〕。MDM2也参与肿瘤的发生发展。MDM2通过与抑癌基因p53相互调节而发挥作用，过表达MDM2可帮助肿瘤细胞逃避抑癌基因对细胞的生长调节。MDM2也参与肿瘤的侵袭与转移。研究发现MDM2可促进MMP-9表达，两者呈正相关〔16〕。

综上，IGF可能通过AKT信号通路，上调MMP-9及MDM2蛋白表达，下调E-cadherin蛋白表达，进而促进人肺癌A549细胞增殖，侵袭与转移。这提示IGF-1可能参与肺癌的发生发展与转移。对IGF-1的深入研究可能为揭示肿瘤的发生机制提供理论依据，并为临床靶向治提供新的靶点。