褪黑素基于JAK-STAT通路对MPP+诱导的PC12细胞炎性损伤的影响

马一闻 陈超 毕素贞 庄文欣 付文玉 吕娥

(潍坊医学院 1生物科学与技术学院，山东 潍坊 261053；2医学研究实验中心；3组织学与胚胎学教研室)

帕金森病(PD)是广泛存在于中老年群体的神经退行性疾病，PD的确切发病机制是医学界的一大难题，目前已经确定PD的病理症状以不能运动，休息震颤和多巴胺(DA)能神经元的丧失为特征〔1〕。已有大量研究表明由胶质细胞激活触发的神经炎症在PD的发病机制中起着重要作用。活化的细胞产生促炎因子等炎症介质，又反向刺激于这些细胞来表达炎性因子〔2〕。Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)途径普遍存在由干扰素和细胞因子激活的信号转导，在免疫应答的起始和调节中起关键作用。JAK/STAT途径的异常激活在诸如PD和多发性硬化的神经炎症疾病中非常明显〔3〕。白细胞介素(IL)-6是JAK/STAT途径中最有效的激活剂之一，PD中明显升高，且与PD的患病风险密切相关〔4〕。

褪黑素(MT)是一内源性神经激素，且具有多靶点生物活性的小分子物质〔5〕。本课题组发现，MT对1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)所致的PD小鼠模型上有较好的抗炎效果，而MT抑制神经炎症反应的机制不明。结合JAK-STATs信号通路的特性和MT多靶点治疗研究进展，本研究拟采用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶脱氢物(MPP+)损伤PC12细胞的PD模型，探讨 MT的抗神经炎症作用及利用JAK/STAT通路改善神经炎症的可能性，从而为MT防治神经退行性疾病的研究提供可靠的理论基础。

1 材料和方法

1.1细胞、试剂和仪器 小鼠嗜铬细胞瘤(PC)12细胞(上海中国科学院细胞库)；MT、MPP+、细胞裂解液(RIPA)(均Sigma公司)；胎牛血清和RPMI-1640(均HyClone公司)；细胞毒性/增殖检测试剂盒CCK-8(YEASEN公司)；胰蛋白酶(Solarbio公司)；兔抗多克隆抗体磷酸化的(p)-STAT1、p-STAT3、STAT1、STAT3(均Immunoway公司)；兔抗多克隆抗体IL-17A、IL-1β和IL-6(均Bioss公司)；化学发光液(Thermo 公司)。Multiskan FC型酶标仪(Thermo Fisher公司)；Western印迹高电流电泳仪(BIO-RAD公司)；化学发光凝胶成像系统(爱博科技贸易公司)。

1.2细胞分组及处理 细胞培养基为10%胎牛血清加1%青链霉素混合液(青链霉素浓度均为100 μg/ml)，培养于5% CO2、37℃恒温培养箱中。传至4代后，胰蛋白酶消化(0.25%)处于对数期且状态良好的细胞，并制成细胞悬液调配到适宜浓度后接种于孔板中，并分为如下四组：对照组；模型组：200 μmol/L的MPP+干预36 h(预实验中检测不同浓度MPP+的损伤效果，其中200 μmol/L最佳)；治疗组：200 μmol/L的MPP+处理12 h后，再加入800 μmol/L的MT处理24 h(预实验中采用不同药物浓度进行筛选，发现800 μmol/L MT修复效果最佳，后续实验采用此浓度给予干预)；MT组：加入800 μmol/L的MT处理24 h(与治疗组加入MT的时间相同)。

1.3显微镜观察细胞形态 将各组细胞混悬液滴加到6孔板中，接种各孔剂量1 ml浓度为3×105个/ml，12 h后将细胞分组及药物干预，每隔12 h观察细胞并拍照。

1.4CCK-8法检测细胞活性 将制好的细胞混悬液以4×103个/ml浓度每孔100 μl的剂量滴加到96孔板中，细胞分组并给予MPP+及MT干预，吸去原有培养基，加入CCK-8培养基混合液100 μl并置于培养箱中培养3 h后，酶标仪检测各孔450 nm的吸光度值。

1.5免疫细胞化学法检测IL-1β、IL-6的含量 将PC12细胞浓度为1×105个/ml的悬液以400 μl每孔的剂量滴加到24孔板中进行爬片，培养12 h后分组并加药干预。吸除各孔中培养基，依照刘金城等〔6〕方法步骤进行细胞处理和后续细胞免疫组织化学流程，一抗为兔抗IL-1β(1∶200)、IL-6(1∶200)抗体(30 μl/孔)，结果采用Image Pro Plus5.1软件进行平均光密度值(MOD)分析。

1.6Western印迹法检测IL-17A、IL-6、p-STAT1、p-STAT3、STAT1和STAT3的蛋白表达 将3×105个/ml PC12细胞悬液接种至6孔板中每孔1 ml，细胞分组给予药物，蛋白提取、浓度检测、Western印迹的详细步骤及显影参照刘飞等〔7〕的实验方法，实验中滴加一抗，分别为兔抗多克隆抗体IL-17A(1∶1 500)、IL-6(1∶1 500)、p-STAT1(1∶800)、p-STAT3(1∶800)、STAT1(1∶1 000)、STAT3(1∶1 000)和小鼠抗GAPDH(1∶1 000)抗体。实验结果采用Image J软件分析各组条带的吸光度(AA)，目的蛋白AA与GAPDH蛋白AA比值表示各目的蛋白的相对表达值。

1.7统计学分析 采用SPSS17.0软件行t检验。

2 结 果

2.1MT可修复MPP+对PC12细胞的损伤 对照组细胞分布均匀，胞体发出不规则突起；模型组漂浮细胞大量出现，细胞内有空泡，细胞出现聚集，折光性升高，胞体萎缩变圆颜色发暗；而给予MT后，治疗组细胞状态有所好转，贴壁细胞数量增多，聚集现象及萎缩的胞体较少，细胞折光性降低；MT组细胞分布状态、外形结构、生长状态及后续各项检测与对照组相比，均无显著性差异。见图1。

2.2MT可阻止MPP+导致的 PC12细胞活力的下降 与对照组(0.66±0.04)相比，模型组细胞活力(0.40±0.07)明显变弱；与模型组比较，给予MT后治疗组细胞活力明显好转(0.58±0.09，P<0.05)，MT组细胞活力(0.69±0.04)与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3MT可降低MPP+诱导的PC12细胞的神经炎症反应 与对照组相比，模型组IL-1β、IL-6 MOD及IL-17A、IL-6蛋白表达显著增加(P<0.05)，与模型组比较，治疗组IL-1β、IL-6 MOD及IL-17A、IL-6蛋白表达明显减少(P<0.05)。MT组IL-1β、IL-6 MOD及IL-17A、IL-6蛋白表达与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1，图2。对照组细胞形态良好，染色较淡；而模型组部分细胞内存在空泡，且存在聚集现象，阳性细胞染色加深；与模型组比较，治疗组细胞状态较好，细胞空泡较少，染色变淡。见图3。

2.4MT可抑制MPP+诱导的PC12细胞的JAK-STATs信号通路的激活 与对照组比较，模型组p-STAT1、p-STAT3表达均明显增高(均P<0.05)，与模型组比较，治疗组p-STAT1、p-STAT3明显降低(均P<0.05)。各组STAT1、STAT3无明显变化。MT组各指标与对照组均无统计学差异(P>0.05)。见图4、表2。

表1 各组PC12细胞IL-1β和IL-6MOD、IL-17A和IL-6蛋白表达

与对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；下表同

图2 IL-17A和IL-6蛋白在各组PC12细胞的相对表达

图3 IL-1β和IL-6在各组PC12细胞中的表达(DAB，×200)

图4 p-STST1、STAT1、p-STAT3和STAT3蛋白在各组PC12细胞的相对表达

表2 各组PC12细胞p-STST1、STAT1、p-STAT3和STAT3蛋白表达相对值

3 讨 论

全基因组关联研究表明，强调了中枢神经系统疾病(包括PD)的发病机制或调节与免疫系统基因的关联，认为神经炎症反应和促炎介质释放的调节可能会影响症状和严重程度〔8〕。临床研究发现伴有震颤的PD患者在脑脊液和血清中IL-6水平 显著增强〔9〕。本实验发现，在给予MPP+处理后，细胞状态呈现显著恶化，细胞活力明显降低，促炎因子IL-17A、IL-1β和IL-6表达显著上升。

先天性免疫反应在神经炎症中具有致病和保护作用，这取决于疾病的发病机制和中枢神经系统所处的微环境，小胶质细胞、T细胞等是参与监测该微环境的主要细胞〔10〕，而JAK/STAT途径的激活可加重致病性神经炎症的进展。Zhu等〔11〕用特异性JAK抑制剂预处理可减少STAT3的磷酸化并阻断抗炎因子IL-10介导的针对脂多糖(LPS)损伤的腹侧中脑原代神经元的保护作用。用聚集的α-突触核蛋白(SYN)刺激小胶质细胞系或原代小胶质细胞可导致主要组织相容性复合因子(MHC)Ⅱ类的表达和一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNF)-α和IL-1β产生，通过JAK1/2抑制剂AZD1480可抑制JAK/STAT途径的激活〔12〕。Przanowski等〔13〕在LPS导致的模型上发现，p-STAT1、p-STAT3、p-STAT5可诱发产生促炎因子。本研究发现给予MPP+可诱发PC12细胞p-STAT1、p-STAT3表达上升。

MT是由松果体分泌的一种具有睡眠调节、增强免疫、抗癌活性、抗炎抗氧化特性和神经保护等强大功能的吲哚类激素〔14〕，可通过质膜上的特定细胞受体或其他非受体依赖性途径发挥其作用。MT可调节自身免疫性脊髓炎小鼠模型的少突胶质细胞的功能，减少促炎因子(IL-1β和TNF-α)和增加抗炎因子(IL-4和IL-10)来减轻炎症，降低神经功能障碍评分并增强髓鞘再生〔15〕。MT对6-羟基多胺(OHDA)诱导的偏侧PD大鼠模型具有抗氧化和神经保护作用〔16〕，可对表达PD相关表型基因parkin/PINK1/DJ-1/MUL1的斑马鱼胚胎发挥挽救作用〔17〕。本实验发现，MT可有效减轻MPP+诱导PC12细胞所产生的炎症反应并抑制p-STAT1和p-STAT3表达。

综上，MT可降低MPP+诱导的炎症反应，并通过进一步探讨发现MT可抑制JAK-STATs信号通路中p-STAT1和p-STAT3表达来降低IL-1β、IL-6、IL-17A等促炎因子的表达，进而参与神经保护作用，为MT在PD的临床治疗提供了可靠的实验和理论依据。