EN2及β-catenin在卵巢癌组织中的表达及临床意义

宋 晨 王春莲 赵丽荣 王箴言 戴红英

卵巢癌发生率较高，是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，癌症致死率位居第8位[1]。每年约有24万女性被诊断患有卵巢癌，5年生存率约为45%，严重威胁女性生命健康[2,3]。Engrailed-2(EN2)基因是同源异型盒基因家族的成员之一，在胚胎和神经系统发育中起着重要的作用[4]。既往研究表明，EN2基因在多种类型的恶性肿瘤中均有高表达，包括前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌及卵巢癌[5～8]。进一步研究发现，EN2可作为Wnt信号通路的关键性信号之一，参与调控细胞分化，并能通过调控Wnt信号转导通路中β-连环蛋白(β-catenin)调控细胞增殖[9]。本研究通过免疫组化法检测了EN2、β-catenin在卵巢癌、交界性肿瘤、良性肿瘤及正常卵巢组织中的表达，旨在探究EN2、β-catenin蛋白在卵巢癌组织中的表达水平及其与患者临床病理学的相关性。

资料与方法

1.研究对象：收集笔者医院2012年1月～2013年12月收治的卵巢肿瘤患者的病例资料共110例，其中卵巢癌60例，交界性肿瘤28例，良性肿瘤22例，患者年龄45～70岁，平均年龄50.5岁。所有患者均为首发病例，在术前均未接受过化疗或放疗，术后均经病理检查进一步诊断确诊，且所有患者病历资料完整。此外，收集同期因子宫良性病变行卵巢切除术的20例正常卵巢组织作为对照组。临床病理分期按照国际妇产科协会(International Federation Of Gynecology And Obstetrics, FIGO)2009年分期标准，卵巢癌临床早期Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期40例；分化程度：高分化(G1)17例、中分化(G2)12例，低分化(G3)31例；发生淋巴结转移17例，无淋巴结转移者43例；浆液性腺癌43例，黏液性腺癌17例。正常对照组年龄45～68岁，平均年龄52.4岁。

2.免疫组化法检测：对所有病理组织进行石蜡包埋，将所有石蜡包埋后的病理组织进行连续切片，切片厚度4μm，展开切片后在玻片上进行贴片，脱蜡修复后，滴加一抗后室温孵育1～2h，洗涤后滴加二抗，室温孵育15～20min，洗涤后DAB显色5min，苏木精复染细胞核30s，脱水后封片。

3.结果判定：以细胞质出现淡黄色至棕黄色或棕褐色为细胞染色阳性，综合阳性细胞数及染色强度判断，0～4分为EN2或β-catenin染色阴性，5～12分为EN2或β-catenin染色阳性，以阴性表达为低表达，阳性表达为高表达。低倍镜下观察整张切片，高倍镜下随机选取5个视野计数阳性细胞数。所有染色结果均由两名经验丰富的病理科医生采用双盲法在光镜下进行观察。

结 果

1.EN2蛋白在不同卵巢组织中的表达情况：免疫组化结果显示，EN2表达于细胞质内且在所有的检测样本中均有表达(图1)，卵巢癌组织及交界性肿瘤组织EN2阳性表达率明显高于正常组织，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

图1 EN2及β-catenin蛋白在不同卵巢组织中的表达情况(免疫组化，×200)

表1 不同组织中EN2蛋白表达情况[n(%)]

与对照组比较，*P<0.05

2.β-catenin蛋白在不同卵巢组织中的表达情况：免疫组化结果显示，β-catenin表达于细胞质内且在所有的检测样本中均有表达(图1)，卵巢癌组织及交界性肿瘤组织β-catenin阳性表达率明显高于正常组织，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 不同组织中β-catenin蛋白表达情况[n(%)]

与对照组比较，*P<0.05

3.EN2蛋白表达与卵巢癌临床病理特征之间的关系：EN2蛋白的阳性表达与患者年龄、卵巢癌病理类型无显著相关性(P>0.05)；EN2蛋白在低分化卵巢癌组织中的阳性表达率明显高于高分化组，差异有统计学意义(P<0.05)；EN2蛋白在早期(Ⅰ～Ⅱ)卵巢癌中的阳性表达率与晚期(Ⅲ～Ⅳ)卵巢癌比较，差异无统计学意义(P>0.05)；EN2蛋白淋巴结转移卵巢癌中的阳性表达率与未转移的卵巢癌比较，差异无统计学意义(P>0.05，表3)。

表3 EN2表达与临床病理特征相关情况[n(%)]

与高分化比较，*P<0.05

4.β-catenin蛋白表达与卵巢癌临床病理特征之间的关系：β-catenin的阳性表达与患者年龄、卵巢癌病理类型无显著相关性(P>0.05)；β-catenin蛋白在低分化卵巢癌中的阳性表达率明显高于高分化组，差异有统计学意义(P<0.05)；β-catenin蛋白在早期(Ⅰ～Ⅱ)卵巢癌中的阳性表达率与晚期(Ⅲ～Ⅳ)卵巢癌比较，差异无统计学意义(P>0.05)；β-catenin蛋白淋巴结转移卵巢癌中的阳性表达率与未转移的卵巢癌比较，差异无统计学意义(P>0.05，表4)。

表4 β-catenin表达与临床病理特征相关情况[n(%)]

5.EN2与β-catenin表达的相关性分析：Spearman等级相关性分析结果显示，EN2、β-catenin在卵巢癌中的表达呈正相关(P<0.05)，详见表5。

表5 EN2与β-catenin之间的相关性[n(%)]

讨 论

卵巢癌5年生存率低、预后差,因此，明确卵巢癌的发病机制、探索有效的治疗手段尤为重要。同源异型盒基因(homeobox，HOX)作为转录因子，可与特定的DNA区域结合，激活或抑制靶基因的表达，进而参与细胞凋亡、运动与分化、血管生成和器官功能维持等多种生物学过程[10～12]。EN2基因属于HOX家族，在人类胚胎期神经系统发育过程中起着至关重要的作用[13～15]。有报道指出，EN2可能在胚胎的早期发育和神经系统功能的维持中起着重要作用，并且与神经系统发育缺陷和自闭症的发展密切相关[4]。

研究发现，EN2与肿瘤的发生和发展密切相关，在某些类型的癌症中可能充当肿瘤抑制基因[16,17]。Martin等[6]报道，乳腺癌细胞中EN2的表达上调，可能促进了肿瘤细胞的增殖。Bose等[18]研究显示，前列腺癌细胞系中的EN2表达水平上调，而EN2表达的沉默可能通过下调PAX2基因表达来抑制前列腺癌细胞的增殖。McGrath等[8]对8种上皮性卵巢癌细胞株及100例术后卵巢癌组织中EN2的表达水平进行了研究分析，结果显示卵巢癌细胞系及浆液性卵巢癌癌症组织中EN2 mRNA表达水平明显高于正常对照组，提示EN2可能有一定的预测价值。Wnt/β-catenin信号是经典Wnt通路，通过激活下游靶基因的转录与表达，调控细胞生长。李云飞等[19]研究发现，EN2及β-catenin在同一种癌症中的表达均明显增高，说明EN2可能通过激活Wnt/β-catenin信号通路，参与肿瘤的发生、发展。

本研究发现，EN2及β-catenin在卵巢癌中的表达明显增加，这与McGrath等[8]的研究结果一致，表明EN2及β-catenin的高表达可能与卵巢癌的发生、发展有关。本研究EN2及β-catenin的表达与卵巢癌的分化程度显著相关，但与患者年龄、卵巢癌类型、临床病理分期及有无淋巴结转移无关，提示EN2及β-catenin蛋白可能与卵巢癌的浸润、进展、转移无关。本研究EN2及β-catenin的表达与卵巢癌的病理分期及淋巴结转移无显著相关性，但有相关性趋势(P=0.08)，其原因可能与样本量少有关。今后的研究中需进一步收集病理数据，探究EN2及β-catenin的表达与病理分期及淋巴结转移的关系。Spearman相关性分析结果表明，卵巢癌组织中EN2与β-catenin的蛋白表达呈正相关，二者均与组织学分级显著相关，推测EN2与β-catenin在卵巢癌的发生、发展过程中存在协同作用。

综上所述，卵巢癌组织中EN2及β-catenin蛋白表达明显增高，并与病理分化程度呈正相关，提示EN2及β-catenin可能在卵巢癌的发生过程中作为肿瘤促进因子发挥生物学作用。