lncRNA LINC01015在肾癌患者组织中的表达及其对肾癌细胞增殖和迁移的影响

鲁帅奇 李小辉 郝彤彤 韩兴涛 张 寒

肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，起源于肾小管上皮[1]。针对肾癌的治疗方式以手术切除为主，然而肾癌的预后较差且较易复发，严重影响肾癌患者的生命健康[2]。明确肾癌发生和转移的分子机制，对于寻找肾癌肿瘤标志物、实现早期诊断和分子靶向治疗具有重要意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类长度超过200个核苷酸的单链RNA，主要定位于细胞核和细胞质，不具有编码蛋白质的功能[3]。lncRNA通过表观遗传调控、剂量补偿效应、转录调控等多水平影响基因表达，参与人体细胞的分化、组织发育[4]。大量研究证实，lncRNA在包括肾癌在内的多种恶性肿瘤中异常表达，且与肿瘤细胞的恶性表型如增殖、迁移、侵袭、耐药性、抗凋亡等显著相关[5]。LINC01015属于lncRNA家族成员，在肾癌中的表达和分子作用机制尚未见报道。本研究通过qPCR技术在肾癌组织和细胞株中分别检测LINC01015的表达水平, 并通过转染LINC01015质粒，明确高表达LINC01015对肾癌细胞增殖能力、迁移能力的影响，旨在阐明LINC01015在肾癌进展中的作用机制。

材料与方法

1.材料:(1)临床标本:选取郑州大学附属洛阳中心医院泌尿外科2017年3月～2018年11月手术治疗的肾癌患者82例，留取保存肾癌组织及癌旁组织，组织标本均经病理学确诊。患者年龄45.80±11.87岁，术前均未接受过放射治疗、化学治疗。本研究经笔者医院医学伦理学委员会批准，患者均签署知情同意书。(2)细胞与试剂：肾癌细胞株(Caki-1、ACHN、786-O、OS-RC-2、A498)和正常肾小管上皮细胞(HK-2)购自中国典型培养物保藏中心；LINC01015质粒和阴性对照质粒购自苏州吉玛基因股份有限公司；RPMI1640培养基、DMEM/F12培养基和胎牛血清购自美国Hyclone公司；转染试剂LipofectamineTM3000购自美国Invitrogen公司；荧光实时定量PCR(qPCR)试剂盒购自天根生化科技有限公司；噻唑蓝(methyl thiazol tetrazolium，MTT)试剂盒和二甲基亚砜购自南京凯基生物科技发展有限公司；Transwell小室购自美国康宁公司；一抗购自美国Cell Signaling Technology公司；ECL显影液购自美国Thermo公司;二抗购自武汉博士德生物有限公司。

2.方法：(1)细胞培养与转染：Caki-1、ACHN、786-O、OS-RC-2、A498培养在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，HK-2培养在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中，在37℃、5% CO2下常规培养。取对数生长期的Caki-1细胞均匀接种于6孔板，当细胞密度达到70%时，采用LipofectamineTM3000 根据操作说明书将LINC01015质粒和阴性对照质粒转染至细胞株中，分别命名为实验组和对照组。转染24h后更换新鲜培养基。(2)qPCR检测 LINC01015、FBXW7 mRNA的表达水平：肾癌组织和细胞总 RNA采用TRIzol试剂提取，反转录为cDNA。产物进行qPCR检测，内参基因为GAPDH。引物序列如下，FBXW7：正向引物：5′-GGCCAAAATGATTCCCAGCAA-3′，反向引物：5′-ACTGGAGTTCGTGACACTGTTA-3′；GAPDH：正向引物：5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，反向引物：5′-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3′； LINC01015：正向引物：5′-TGAGATAAGGATGCATAGGAGACC-3′，反向引物：5′-TGCCTCATCACCATGTCCT-3′。qPCR反应条件为：95℃ 3min，95℃ 30s，56℃ 15s，68℃ 15s，35个循环，荧光信号值采用2-ΔΔCt方法计算。(3)MTT法检测Caki-1细胞增殖能力：将两组Caki-1细胞以4×103个/200微升的细胞密度接种于96孔板。检测时，加入20微升/孔 MTT试剂，混匀后于37℃孵育3h，去上清后加入150微升/孔二甲基亚砜，振荡20min后，酶标仪检测每孔在450nm波长处的吸光度(A)值。使用MTT法检测各组细胞在接种后第1、2、3、4、5天的增殖情况。(4)Transwell迁移实验检测Caki-1细胞迁移能力:将两组Caki-1细胞以4×104个/200微升的细胞密度接种于Transwell上室，加入600μl RPMI1640培养液至Transwell下室。培养24h后，取出Transwell上室，棉签擦去上层未迁移的Caki-1细胞，采用多聚甲醛固定30min，采用结晶紫染液染色30min，采用PBS溶液洗3次。每孔在100倍显微镜下随机选5个视野拍照、计数。(5)Western blot法检测Caki-1细胞FBXW7蛋白表达:使用细胞裂解液进行细胞总蛋白提取，二喹啉甲酸法进行蛋白含量检测。加样进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，采用湿转法转至NC膜。5%脱脂牛奶封闭后，将NC膜进行一抗孵育，在4℃下过夜。洗膜后，将NC膜进行二抗孵育，室温下孵育3h。洗膜后，使用ECL显影液曝光显影。

结 果

1.肾癌组织和癌旁组织中LINC01015的表达:肾癌组织和癌旁组织中LINC01015的表达分别为1.32±0.41和5.56±0.67，肾癌组织中LINC01015表达低于癌旁组织(P<0.01)。

2.肾癌细胞和正常肾小管上皮细胞中LINC01015的表达:肾癌细胞株(Caki-1、ACHN、786-O、OS-RC-2、A498)和正常肾小管上皮细胞(HK-2)中LINC01015的表达分别为0.11±0.01、0.48±0.04、0.74±0.03、0.34±0.03、0.59± 0.06和1.00±0.02，肾癌细胞系中LINC01015表达均低于正常肾小管上皮细胞(P<0.01)。Caki-1细胞中LINC01015的表达最少(P<0.01)，选择Caki-1细胞进行后续实验(图1)。

图1 肾癌细胞和正常肾小管上皮细胞中LINC01015的表达与HK-2细胞比较，*P<0.01

3.两组Caki-1细胞中LINC01015的表达：收集两组Caki-1细胞，提取总RNA并应用qPCR检测LINC01015的表达。实验组和对照组Caki-1细胞中LINC01015表达分别为11.43±0.77和1.01±0.08，实验组明显高于对照组(P<0.01)。

4.高表达LINC01015抑制Caki-1细胞的增殖能力：MTT法检测两组Caki-1细胞的增殖能力，从第3天起，实验组细胞与对照组比较，增殖能力明显受到抑制(P<0.05，图2)。

图2 MTT检测两组肾癌Caki-1细胞增殖能力与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

5.高表达LINC01015抑制Caki-1细胞的迁移能力:Transwell迁移实验检测两组Caki-1细胞的迁移能力。实验组和对照组Caki-1细胞迁移细胞数分别为68.37±9.64和163.80±21.30，与对照组比较，高表达LINC01015后明显抑制Caki-1细胞的迁移能力，差异有统计学意义(P<0.01，图3)。

图3 Transwell迁移实验检测LINC01015对肾癌Caki-1细胞迁移能力的影响A.Transwell迁移实验检测LINC01015对肾癌Caki-1细胞迁移能力的影响(结晶紫，×200)；B.迁移细胞数的半定量分析;与对照组比较，*P<0.01

6.高表达LINC01015上调肾癌Caki-1细胞中FBXW7 mRNA的表达：qPCR检测两组Caki-1细胞FBXW7 mRNA的表达情况，实验组和对照组Caki-1细胞FBXW7 mRNA的表达分别为5.87±0.49和1.00±0.04， 上调LINC01015能使FBXW7 mRNA表达水平升高(P<0.01)。

7.高表达LINC01015上调肾癌Caki-1细胞中蛋白表达：Western blot法检测结果显示，高表达LINC01015引起FBXW7蛋白表达升高，FBXW7蛋白表达升高后，Mcl-1、mTOR、ENO1、HIF-1α等癌蛋白表达明显降低(图4)。

图4 Western blot法检测蛋白表达情况

讨 论

长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)由于缺少开放阅读框架，不能编码蛋白质，以往被认为是转录过程的“噪声”，不参与调控细胞活动[6]。随着对lncRNA研究的深入，研究者发现lncRNA可显著影响染色质重塑、基因转录和基因翻译过程，影响细胞各种生命活动的调节，在疾病进程中表达差异显著[7]。大量研究表明，lncRNA在肿瘤细胞中低表达或高表达，发挥致癌因子或抑癌因子效应，在肿瘤标志物和靶向治疗方面具有重要的应用价值[8]。近年来，lncRNA已成为肿瘤包括肾癌研究的热点，lncRNA的异常表达影响肾癌的发生、发展。Liu等[9]研究显示，ZFPM2-AS1在肾癌组织中的表达明显增加，通过靶向作用于miR-137，参与肾癌的发生。Shi等[10]报道，lncRNA ROR可通过miR-206/VEGF分子轴，促进肾癌的进展。He等[11]报道，lncRNA FENDRR在肾癌组织中表达明显降低，FENDRR表达水平与肾癌患者的预后明显相关。LINC01015长度为2874个核苷酸，其在肿瘤特别是肾癌中尚未见报道。本研究结果表明，肾癌组织中LINC01015的表达低于癌旁组织，肾癌细胞株中的表达低于正常肾小管上皮细胞，LINC01015可能在肾癌的发生、发展中发挥抑癌因子效应。

本研究选取LINC01015表达最低的Caki-1细胞进行转染，结果发现高表达LINC01015可明显抑制肾癌细胞的增殖能力和迁移能力，进一步证实LINC01015在肾癌中可能发挥抑癌因子效应。F框/WD重复域蛋白7(F-box and WD repeat domain containing 7，FBXW7)蛋白是F-box蛋白家族成员之一，包括F-box蛋白、D结构域和WD-40重复序列等3个结构域，参与调控细胞的多个生物学过程。既往研究表明，FBXW7在胰腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等多种恶性肿瘤中表达降低或功能缺失，与肿瘤的发生、转移、耐药性等恶性表型密切相关[12～15]。FBXW7作为抑癌基因，在肾癌组织中的表达明显降低，高表达FBXW7可抑制肾癌细胞的增殖、迁移和侵袭[16, 17]。本研究高表达肾癌Caki-1细胞中LINC01015后，FBXW7基因的表达明显增加，说明LINC01015具有上调FBXW7基因表达的作用。研究显示， FBXW7基因可作为E3泛素连接酶复合物的底物，识别细胞生长和转移相关癌蛋白如Mcl-1、mTOR、ENO1、HIF-1α的亚基，降解多种癌蛋白的表达，从而抑制肿瘤细胞的生长和转移[12, 16]。本研究显示，FBXW7基因表达上调后，Mcl-1、mTOR、ENO1、HIF-1α等癌蛋白表达明显降低。LINC01015调控FBXW7基因的具体分子机制尚不明确，这是下一步研究的重点。

综上所述，本研究证明了LINC01015在肾癌组织和细胞中呈低表达。高表达LINC01015可抑制肾癌细胞的增殖和迁移能力，其作用机制可能是LINC01015上调FBXW7基因的表达。