β-榄香烯对血管内皮细胞功能紊乱和血管平滑肌细胞异常增殖的影响

段兰兰，董 菁，范香成，朱俊艺，张逸凡，韩吉春，尚 靖,3*

（1中国药科大学中药学院，南京211198；2中国药科大学江苏省中药评价与转化重点实验室，南京211198；3中国药科大学天然药物活性组分与药效国家重点实验室，南京210009）

心血管疾病是目前我国引起死亡的主要疾病之一。随着生活水平和生活习惯的改变，我国的心血管疾病发病率也逐年升高，严重威胁着我国人民的健康。动脉粥样硬化是心血管疾病中最为常见的类型之一，也是引发心血管疾病患者死亡的主要原因之一［1］。因此，寻找一种安全、有效、低毒的治疗动脉粥样硬化药物十分必要。

氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）是动脉粥样硬化的独立危险因素，能够促进血管平滑肌细胞（VSMCs）迁移和增殖、促进泡沫细胞和血栓的形成，最后导致了动脉粥样硬化的发生［2-3］。一些临床研究发现，动脉粥样硬化患者的斑块多发生于血管弯曲处内侧或血管分叉处外侧，这一发现说明血流动力学可能也参与了动脉粥样硬化的发生［4］。目前很多研究发现低剪切力（LSS）可以损伤血管内皮细胞（ECs），诱导ECs 产生大量的ROS，诱发ECs 功能紊乱，促进动脉粥样硬化的发生和发展［5-6］。

β-榄香烯是从姜科植物温郁金中提取的抗肿瘤有效成分，具有很好的抗肿瘤作用［7-8］。本课题组前期的研究发现，β-榄香烯可以减轻高脂饲料诱导的ApoE（-/-）小鼠动脉粥样硬化症状［9-10］，但是具体的作用机制并不清楚。本研究主要通过建立LSS 诱导的ECs 功能紊乱和ox-LDL 诱导的VSMCs增殖迁移模型，研究β-榄香烯对ECs 功能紊乱和VSMCs 增殖迁移的影响，为β-榄香烯治疗动脉粥样硬化提供理论基础。

1 材 料

1.1 试 剂

β-榄香烯［含量99%，石药集团远大（大连）制药有限公司］；噻唑蓝（MTT，美国Sigma 公司）；DMEM 培养基、RPMI 1640 培养基（美国Gibco 公司）；Akt 抗体、p-Akt 抗体、ERK 抗体、p-ERK 抗体、β-actin 抗体、二氢乙锭、3-氨基，4-氨基甲基-2′，7′-二荧光素、二乙酸酯（美国Abcam 公司）；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪 器

LEGEND Micro 21R 型离心机（美国Thermo Scientific公司）；BS210S电子天平（德国Sartorius公司）；荧光倒置显微镜（日本Olympus 公司）；iCycler iQ5（美国Bio-Rad 公司）；核酸定量仪（美国Amerscham Biosciences 公司）；Veriti 96逆转录仪器（美国ABI 公司）；Tanon 5200 多倍镜（中国山海塔农科技公司）。

1.3 细 胞

大鼠胸大动脉平滑肌细胞株（A7r5）和人脐静脉内皮细胞株（EA. hy926 即ECs）均来源于ATCC公司。

2 方 法

2.1 细胞培养

取生长状态良好的A7r5 细胞，使用含10%胎牛血清、链霉素（100 μg/L）、庆大霉素（100 μg/L）的DMEM培养液（pH 7.5），在37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期细胞进行各项实验。

取生长状态良好的ECs，使用含10%胎牛血清、链霉素（100 μg/L）、庆大霉素（100 μg/L）的RPMI 1640 培养液（pH 7.5），在37 ℃、5% CO2饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期细胞进行各项实验。

2.2 剪切力诱导内皮细胞功能紊乱

采用平行板流动腔建立ECs功能紊乱模型，造模方法与文献一致［6］，大体操作如下：将ECs 爬片贴壁后置于可体外模拟LSS的平行板流动腔中，施加剪切力0.2 Pa于贴壁的细胞，作用30 min即可。

2.3 二氢乙锭法检测ECs中ROS活性

取处于对数生长期的细胞，细胞的密度按照每毫升5× 105个细胞接种于含有盖玻片的6 孔培养板中，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。将实验分为5 组：正常组、模型组和3 个不同浓度的β-榄香烯（0.1、1、10 mg/L）组。正常培养24 h 后，换用无血清培养基继续培养12 h，使细胞同步化。给药组分别用含有不同浓度的β-榄香烯（0.1、1、10 mg/L）的无血清培养基预培养24 h，其余组只用无血清培养基培养相同时间，去除培养液，用PBS 洗2 次，加入DHE 于37 ℃培养箱中避光孵育20 min。用PBS洗3次，并将盖玻片置于荧光显微镜下拍照。

2.4 3-氨基，4-氨基甲基-2′，7′-二荧光素，二乙酸酯法检测ECs中NO活性

具体细胞给药操作步骤同“2.3”项，用PBS 洗过后加入DAF-FM DA 于37 ℃培养箱中避光孵育20 min。用PBS 洗3 次，并将盖玻片置于荧光显微镜下拍照。

2.5 Western blot 法检测检测ECs 中Akt 和ERK的蛋白磷酸化水平

具体细胞给药操作步骤同“2.3”项，PBS 洗过后加入蛋白裂解液50 μL 置于冰上静置20 min 后用细胞刮刀将细胞刮下并转移至1.5 mL 离心管内，于离心机内4 ℃，1 350 r/min，离心5 min后收集上清液即为蛋白悬浮液。通过在10%聚丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE 分离ECs 的裂解物，并将蛋白转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶在室温下封闭1 h，然后与一抗（Akt 抗体、p-Akt 抗体、ERK 抗体、p-ERK 抗体、β-actin 抗体）（所有抗体以1∶1 000 稀释度使用）在4 ℃下反应18 h，然后与相应的次级辣根过氧化物酶结合抗体反应（所有抗体以1∶1 000稀释）在室温下放置2 h。利用ECL检测系统对蛋白质进行可视化检测。用Tanon 5200 多倍镜进行光密度分析扫描信号。本文报道的Western blot检测结果代表了重复3次的结果。

2.6 MTT 法检测不同浓度ox-LDL 对A7r5 细胞活力的影响

选取处于对数生长期的A7r5 细胞，用0.25%的胰酶进行消化，按照每毫升2×104～4×104个细胞的密度制成细胞悬液，并将细胞接种于96 孔板中（每孔180 μL），置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h。弃去培养基，用PBS 清洗2 次，换上含有不同浓度的ox-LDL（0，20，40，60，80，100，200 mg/L），置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养24 h后，每孔加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，继续培养4 h 后，吸弃培养基，加入DMSO 200 μL，摇床振荡10 min，用酶标仪测定波长570 nm 处吸收度，计算细胞活力，以选出ox-LDL的适合浓度。

2.7 MTT 法检测β-榄香烯对A7r5 细胞增殖的影响

按“2.6”项方法筛选出适合浓度的ox-LDL（80 mg/L）建造A7r5 细胞增殖迁移模型。将实验分为5 组：正常组、模型组和3 个不同浓度的β-榄香烯（0.1、1、10 mg/L）组。通过MTT法检测β-榄香烯对A7r5细胞增殖的影响，操作步骤与“2.6”项方法一致。

2.8 细胞划痕法检测A7r5细胞迁移

选取处于对数生长期的A7r5细胞接种于培养皿中，将实验分为5 组：正常组、模型组和3 个不同浓度的β-榄香烯（0.1、1、10 mg/L）组。当细胞的生长覆盖面积约90%时，在培养皿底部做一直线标记，用无菌枪头沿着标记作划痕，PBS 漂洗后加入含有1%胎牛血清的DMEM 培养基（含有对应组别的药物）继续培养，并分别在0和24 h进行拍照，并用Image-Pro Plus 软件进行分析，以划痕闭合比率来评估细胞迁移程度。

1589 年的佛罗伦萨 《幕间剧》（Intermezzi）㊴也是《图像学》较为重要的借鉴资源。研究中发现，里帕正是据此对各类文学体裁的拟人形象进行构思设计，如1593年初版中的“Poema Eroico”（史 诗）、“Poema Pastorale”（田 园 诗）、“Poema Satirico”（讽喻诗）㊵等拟人形象，当时遗漏了同类的“Poema lirico”（抒情诗），学者曼多夫斯基认为是里帕重读此书时发现自己忘记翻页而错过了这个拟人形象，1603年版中便又添上。

2.9 Transwell法检测A7r5细胞迁移

选取处于对数生长期的A7r5 细胞，实验前换用无血清的DMEM 培养基进行饥饿培养24 h。用胰酶消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用无血清的DMEM 重悬。取细胞悬液200 μL分别加入5个Transwell小室中，分别标记：正常组、模型组和3个不同质量浓度的β-榄香烯（0.1、1、10 mg/L）组，调整细胞密度为每孔3×104个细胞，下室中β-榄香烯组分别加入含药物血清培养基（质量浓度为0.1、1、10 mg/L），其余组别只加入血清培养基。正常培养24 h，将小室取出，弃去小室中的培养液，用PBS 洗1～2 遍后倒扣风干。将风干的小室放入已加入4%多聚甲醛600 μL的孔板中，对小室底部背面穿过的细胞进行固定30 min。取出固定好的小室，风干后放入结晶紫染液中染色20 min。将染完色的小室用PBS 洗3遍，然后用棉签擦尽小室内部未迁移的细胞，在倒置显微镜下观察，拍照计数。

2.10 RT-qPCR 法 检 测A7r5 细 胞 中MMP-2 和MMP-9的基因表达

引物设计与合成：MMP-2 引物（上游5′-GCT TCC AGG GCA CCT CTT ACA-3′；下 游5′-ACC TTC TGA ATT TCC ACC CAC AG-3′）、MMP-9 引物（上游5′-CCA TGT CAC TTT CCC TTC ACC TT-3′；下游5′-GCC ATG CTC CGT GTA GAG ATT C-3′），引物由Primer3 software设计与合成。

细胞总RNA 的提取：取培养24 h后的正常组、模型组和3 个不同质量浓度的β-榄香烯（0.1、1、10 mg/L）组的A7r5 细胞，分别制成细胞悬液转移至离心管中离心，弃上清液后按照RNA 提取说明书的方法采用Trizol溶液提取细胞总RNA。

RNA 的逆转录反应：按照说明书配制RT 反应液（5×反转录试剂2 μL，总RNA，用无核酸酶水补足至10 μL），置于逆转录仪中反转录成cDNA。

荧光定量PCR 检测：以上述反转录cDNA 为模板，应用荧光定量PCR检测细胞中MMP-2和MMP-9 的基因表达。25 μL 反应体系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，灭菌双蒸水补足至25 μL。扩增条件为预变性95 ℃30 s，变性95 ℃5 s，退火60 ℃30 s，以上两步扩增循环。每个循环结束后收集荧光信号，反应结束后确认扩增曲线和融解曲线。

2.11 数据处理和统计学分析

统计学处理应用SPSS 10.0 软件进行统计学处理，Origin 8.0 处理图片，数据采用表示，组间比较采用t检验，多组均数比较采用方差分析，当P＜0.05时，则表示具有显著性差异。

3 结 果

3.1 β-榄香烯改善LSS诱导的ECs功能紊乱

通过检测ECs 中ROS 和NO 的活性来评估β-榄香烯对LSS 诱导的ECs 功能紊乱的改善作用。结果如图1 所示，ECs 经过30 min 的LSS 处理后，ROS 的活性显著升高，而NO 的活性却显著性降低。β-榄香烯治疗可以显著降低LSS 诱导的ROS升高，升高LSS 诱导的NO 降低，并具有一定的剂量依赖性。这些结果均表明，β-榄香烯可以改善LSS诱导的ECs功能紊乱。

3.2 β-榄香烯对ECs中Akt和ERK的蛋白磷酸化水平的影响

通过Western blot 法检测检测ECs 中Akt 和ERK的蛋白磷酸化水平的变化。结果如图2所示，在ECs 中，β-榄香烯可以显著降低LSS 所诱导的ERK的磷酸化升高，并可以显著升高LSS所诱导的Akt的磷酸化降低。

3.3 β-榄香烯抑制ox-LDL诱导的A7r5细胞增殖

为了确定适合浓度的ox-LDL 建造VSMCs 增殖迁移模型，本研究使用MTT 法检测了不同浓度的ox-LDL 对A7r5 细胞增殖和迁移的影响。结果如图3-A 所示，80 mg/L ox-LDL 可以显著增加A7r5细胞发生增殖。因此，本研究选择了80 mg/L 的ox-LDL 建造VSMCs 增殖迁移模型。使用MTT 法检测β-榄香烯对ox-LDL 诱导的A7r5 细胞增殖的影响。结果发现，β-榄香烯可以显著降低ox-LDL诱导的A7r5 细胞增殖，并具有一定的剂量依赖性（图3-B）。

3.4 β-榄香烯抑制ox-LDL诱导的A7r5细胞迁移

通过细胞划痕实验和Transwell法检测A7r5细胞迁移。结果如图4 所示，ox-LDL 可以诱导A7r5细胞发生明显的迁移现象，β-榄香烯治疗可以显著抑制ox-LDL 诱导的A7r5 细胞迁移，并具有一定的剂量依赖性。

Figure 2 Effects ofβ-elemene on protein phosphorylation levels of Akt and ERK(±s,n=3)A:Effect ofβ-elemene on the protein phosphorylation level of Akt and ERK in ECs induced by LSS;B:Gray-scale scanning of the protein phosphorylation level of Akt and ERK in ECs. ##P ＜0.01 vs 0 min LSS+0 mg/Lβ-ele; **P ＜0.01 vs 30 min LSS+0 mg/Lβ-ele

Figure 3β-elemene inhibits the proliferation of A7r5 cells induced by ox-LDL(±s,n=3)A:Vability of A7r5 cells upon exposure to different concentrations of ox-LDL for 24 h;B:β-elemene inhibits the proliferation of A7r5 cells induced by ox-LDL at 80 mg/L. #P＜0.05, ##P ＜0.01 vs treatment with 0 mg/L ox-LDL; *P＜0.05, **P ＜0.01 vs treatment with 80 mg/L ox-LDL

Figure 4β-elemene inhibits A7r5 cell migration induced by ox-LDL(±s,n=3)A:A7r5 cell migration was assessed by wound healing assay;B:Quantitative data as the percentage of A7r5 cell migrating into the wound with respect to the cell-free area at the time 0 h;C:Transwell assay was performed to determine the migration of A7r5 cell;D:Quantitative data of A7r5 cell migration. ##P ＜0.01 vs treatment with 0 mg/L ox-LDL; *P＜0.05, **P ＜0.01 vs treatment with 80 mg/L ox-LDL

3.5 β-榄香烯对MMP-2 和MMP-9 基因表达的影响

为了进一步研究β-榄香烯对ox-LDL 诱导的A7r5 细胞迁移影响，本研究使用RT-qPCR 法检测了β-榄香烯对迁移相关的基因（主要是MMP-2 和MMP-9）表达影响。结果如图5 所示，ox-LDL 显著升高A7r5 细胞中MMP-2 和MMP-9 的基因表达。β-榄香烯治疗可以显著降低MMP-2和MMP-9的基因表达，并具有一定的剂量依赖性。

Figure 5 Effects ofβ-elemene on the mRNA levels of MMP-2 and MMP-9(±s,n=3)A:β-elemene significantly reduced MMP-2 gene expression in A7r5 cells induced by ox-LDL;B:β-elemene significantly reduced MMP-9 gene expression in A7r5 cells induced by ox-LDL. ##P ＜0.01 vs treatment with 0 mg/L ox-LDL; *P＜0.05, **P ＜0.01 vs treatment with 80 mg/L ox-LDL

4 讨 论

剪切力是指血液流动时与血管壁内膜面的摩擦力，目前研究已经证实了剪切力参与了动脉粥样硬化的发生［11］。病理研究证实，动脉粥样硬化病变发生的部位为低剪切力处［12］。大量的体内体外的实验研究也发现，低剪切力会诱导ERK 磷酸化和Akt去磷酸化，使血管内皮细胞的ROS活性升高和NO 活性降低，从而造成内皮细胞功能紊乱，最终促进了动脉粥样硬化的发生［13］。本研究采用平行板流动腔在体外模拟低剪切力诱导血管内皮细胞功能紊乱模型。结果发现，低剪切力确实可以诱导ECs 的ROS 活性升高和NO 活性降低，以及诱导ERK 磷酸化的升高，Akt 的磷酸化的降低。β-榄香烯治疗可以显著降低ROS 活性，并升高NO 活性；降低ERK 的磷酸化，并升高Akt 的磷酸化。这一结果说明，β-榄香烯可以改善低剪切力诱导的内皮细胞功能紊乱。

血管平滑肌细胞增殖和迁移也在动脉粥样硬化发病中起着重要的作用［14-15］。Ox-LDL 过量时，它携带的胆固醇堆积在动脉壁上形成了斑块，引起动脉粥样硬化的发生［16-17］。本研究使用ox-LDL诱导血管平滑肌细胞［18］增殖和迁移模型，并检测β-榄香烯对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响。结果发现，ox-LDL 可以诱导血管平滑肌细胞发生显著的迁移和增殖现象，通过β-榄香烯治疗可以显著抑制ox-LDL 诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移。本研究也对与血管平滑肌细胞增殖和迁移相关的基因（MMP-2 和MMP-9）进行检测，结果发现，ox-LDL可以显著升高血管平滑肌细胞中MMP-2和MMP-9 的基因表达，而β-榄香烯可以显著抑制MMP-2 和MMP-9 的基因表达。这一结果说明，β-榄香烯可以抑制ox-LDL 诱导的血管平滑肌细胞增殖和迁移。

总之，β-榄香烯可以改善LSS 诱导的内皮细胞功能紊乱和ox-LDL 诱导的血管平滑肌细胞增殖与迁移。这些结果表明，β-榄香烯的抗动脉粥样硬化作用可能与其在内皮细胞和血管平滑肌细胞上的作用相关。