吴茱萸次碱通过调控表皮生长因子受体活化抑制高血压心肌肥大

严秋江，范秀晶，杨 妍，杨水源，梁金成，曾泗宇*

(1.广州医科大学附属第三医院心胸外科心内二区，广东 广州 510000；2.广东省第二人民医院药学部，广东 广州 510317)

高血压是常见的心血管疾病。心肌肥大是高血压发展为心力衰竭的基本机制，其发生发展与神经内分泌系统(如交感神经系统、肾素-血管紧张素-醛固酮系统)及表皮生长因子受体功能失调有关。尽管血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、钙拮抗剂等已用于心力衰竭的治疗，但心衰患者病死率仍居高不下。因此，抑制高血压心肌肥大，对阻止或延缓高血压发展为心力衰竭具有重要的临床价值。

广东是我国传统中药吴茱萸(包括芸香科植物吴茱萸和疏毛吴茱萸)的重要产地。文献报道，吴茱萸次碱作为吴茱萸的活性单体，可剂量依赖性地降低肾性高血压大鼠血压，其机制与其刺激降钙素基因相关肽的释放有关[1]。研究显示，吴茱萸次碱可抑制异丙肾上腺素介导的左心室心肌肥大[2]。课题组前期研究显示，吴茱萸次碱可抑制腹主动脉缩窄(abdominal artery constriction，AAC)介导的高血压大鼠的心肌肥大，其机理涉及NADPH氧化酶Nox4-活性氧-解整合素金属蛋白酶17通路[3]。上述研究表明中药单体药吴茱萸次碱具有抗高血压心肌肥大效应，但其机理尚未完全阐述清楚。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)活化与高血压心肌肥大的发生发展密切相关，但尚未揭示其与吴茱萸次碱的抗高血压心肌肥大效应的关系。本研究拟以AAC介导的高血压大鼠为研究对象，阐明吴茱萸次碱对高血压引起的心肌肥大的抑制作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

吴茱萸次碱和选择性EGFR抑制剂AG1478分别购自成都曼斯特生物科技有限公司和D&C Chemicals。RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和实时定量聚合酶链反应试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司，基因引物购于上海生物工程技术有限公司。p-EGFR抗体和EGFR抗体购于Abcam公司，细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular signal regulated kinase，ERK1/2)的磷酸化和非磷酸化抗体购于Cell Signaling Technology公司。白介素1β(interleukin 1β, IL-1β)、白介素6(interleukin 6, IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)的酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒购于武汉华美生物工程有限公司。

1.2 AAC介导的高血压大鼠模型的构建

SPF级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠75只(体重180～220 g)，购于中山大学动物实验中心。参照课题组前期方法[4]完成了AAC介导的高血压大鼠模型的构建，假手术组(Sham)组大鼠除未造成腹主动脉狭窄外，其他与手术组操作相同。术后三天连续腹腔注射庆大霉素预防感染；术后1天内有10%大鼠死亡，补做手术以确保每组动物数量为10只。吴茱萸次碱处理分组如下：假手术组，AAC模型组，AAC+吴茱萸次碱低剂量(20 mg/kg)组[AAC+Rut(L)]，AAC+吴茱萸次碱高剂量(40 mg/kg)组[AAC+Rut(H)]，术后第2天开始灌胃给药，连续给药4周。EGFR选择性抑制剂AG1478分组如下：假手术组，AAC模型组，AAC+AG1478(20mg/kg)组，术后第2天开始腹腔注射给药，连续给药4周。

1.3 心肌肥大相关参数的检测

用异氟烷(2%)吸入麻醉大鼠并剃除胸部毛，然后在心脏乳头肌水平用M型超声心动图成像检测(探头频率为8.5 MHz)左室前壁厚度(left ventriculr anterior wall thickness, LVAW)、左室后壁厚度(left ventriculr posterior wall thickness，LVPW)、左心室舒张末期内径(Left ventricular internal diameter during diastole，LVIDd)、左心室收缩末期内径(Left ventricular internal diameter during systole，LVIDs)等心脏参数。

行超声心动图检查后，用3%戊巴比妥钠(45 mg/kg，临用前现配)腹腔注射麻醉大鼠，然后将连通压力传感器的导管(充满肝素)插入至左心室；连接的BL-420S生物信号记录仪连续记录5 min血压。取一段平稳的血压曲线，通过生理分析软件记录主动脉收缩压(Aosp)、主动脉舒张压(Aodp)、左室内压最大上升和下降速率(maximal ascending and declining rate of left ventricular pressure，dp/dtmax)和心率(heart rate，HR)。随后腹腔静脉注射氯化钾注射液(2M)以确保大鼠心脏停留于舒张期，迅速打开胸腔，取出心脏；用预冷的PBS溶液充分灌注并冲洗出心腔残血，然后用电子天平称心脏重量(heart weight，HW)和左心室重量(left ventricular weight，LVW)，分别计算心重体重比(HW/BW)、左心室重指数(LVW/BW)。

1.4 实时定量聚合酶链反应

剪取15～20 mg大鼠心肌组织放入EP管中，用手术剪将组织剪成小块，加入1 mL Trizol后用组织匀浆机将组织匀碎，4 ℃，12 000 g离心10 min，转移上清至一新EP管中，然后按照试剂盒操作步骤提取总RNA以及进行逆转录和实时定量聚合酶链反应。脑利尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)、β-肌球蛋白重链(myosin heavy chain β, β-MHC)、IL-1β、IL-6和TNF-α，及内参GADPH等基因引物见表1。

表1 实时定量聚合酶链反应的引物序列

1.5 蛋白质免疫印迹法

剪取15～20 mg大鼠心肌组织放入EP管中，用手术剪将组织剪成小块，加入蛋白裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)，然后提取组织蛋白并检测EGFR和ERK1/2的磷酸化蛋白水平和总蛋白水平，具体方法见课题组前期研究方法[4]。

1.6 酶联免疫吸附实验

ELISA检测大鼠心肌组织中促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α，具体方法见课题组前期研究方法[5]。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 吴茱萸次碱对AAC介导的高血压大鼠血压的影响

术前各组大鼠收缩压无明显差异；同假手术组比较，术后4周AAC组大鼠主动脉收缩压和主动脉舒张压显著增加(表2)。上述结果提示，AAC介导的高血压大鼠模型构建成功。吴茱萸次碱干预4周后，AAC介导的高血压大鼠主动脉收缩压、主动脉舒张压显著降低。上述研究证实了吴茱萸次碱对AAC介导的高血压大鼠的降压效应。

表2 吴茱萸次碱对AAC介导的高血压大鼠血流动力学参数的影响

2.2 吴茱萸次碱对AAC介导的高血压大鼠心肌肥大的影响

同Sham组比较，术后4周，高血压大鼠左室前壁厚度(LVAW)、左室后壁厚度(LVPD)、HW/BW、LVW/BW以及左心室BNP和β-MHC表达水平显著增加，提示AAC介导的高血压大鼠发生了明显的心室肥厚。同AAC组比较，吴茱萸次碱低剂量组和高剂量组均可显著降低左室前壁厚度(LVAW)、左室后壁厚度(LVPD)、HW/BW、LVW/BW以及左心室BNP和β-MHC表达水平(表3)。因此，吴茱萸次碱能显著削弱AAC介导的高血压大鼠心肌肥大。

表3 吴茱萸次碱对AAC介导的高血压大鼠心肌肥大的影响

2.3 吴茱萸次碱对AAC介导的高血压大鼠左心室中EGFR和ERK1/2活化的影响

同Sham组比较，高血压模型组大鼠左心室EGFR和ERK1/2磷酸化水平显著增加；给予低剂量和高剂量的吴茱萸次碱干预4周，均能显著降低AAC介导的高血压大鼠左心室EGFR和ERK1/2磷酸化水平(图1)。

图1 吴茱萸次碱抑制AAC介导的高血压大鼠左心室EGFR和ERK1/2活化1：假手术组；2：AAC模型组；3：AAC+Rut(L)；4：AAC+Rut.A：EGFR磷酸化水平；B：ERK1/2磷酸化水平与假手术组比较,*P<0.05；与AAC模型组比较，#P<0.05(n=3)

2.4 吴茱萸次碱对AAC介导的高血压大鼠左心室炎症反应的影响

同Sham组比较，AAC介导的高血压大鼠左心室中促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平和蛋白水平显著增加；同高血压模型组比较，低剂量和高剂量的吴茱萸次碱处理4周后，AAC介导的高血压大鼠左心室中促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达显著下降(图2)。因此，吴茱萸次碱能显著改善高血压大鼠心肌炎症反应。

2.5 选择性EGFR抑制剂AG1478削弱AAC介导的高血压大鼠左心室肥大

术前各组大鼠收缩压无明显差异，术后4周AAC大鼠主动脉收缩压和主动脉舒张压均显著增加，而选择性EGFR抑制剂AG1478干预4周并未明显改变AAC大鼠血压，但能降低AAC介导的高血压大鼠左室前壁厚度(LVAW)、左室后壁厚度(LVPD)、HW/BW、LVW/BW以及左心室BNP和β-MHC mRNA的表达水平(表4)。上述结果表明，EGFR抑制通过不依赖血压调控的方式改善高血压介导的心肌肥大。

表4 选择性EGFR抑制剂对AAC介导的高血压大鼠血流动力学参数和心肌肥大的影响

2.6 AG1478抑制AAC介导的高血压大鼠左心室炎症反应和ERK1/2活化

同Sham组比较，AAC介导的高血压大鼠左心室中促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平和蛋白水平以及ERK1/2活性显著增加；同AAC组比较，AG1478处理4周能显著降低AAC介导的高血压大鼠左心室中上述参数(图3和图4)。因此，抑制EGFR活化能显著削弱AAC介导的高血压大鼠心肌炎症反应和ERK1/2活化。

图3 选择性EGFR抑制剂AG1478降低AAC介导的高血压大鼠左心室ERK1/2磷酸化水平1：假手术组；2：AAC模型组；3：AAC+AG1478.A：EGFR磷酸化水平；B：ERK1/2磷酸化水平.与假手术组比较,*P<0.05；与AAC模型组比较，#P<0.05(n=3)

图4 选择性EGFR抑制剂AG1478抑制AAC介导的高血压大鼠心肌炎症反应1：假手术组；2：AAC模型组；3：AAC+AG1478.A-C：左心室促炎症因子IL-1β(A)、IL-6(B)和TNF-α(C)蛋白水平(n=6);D:左心室促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平(n=3).与假手术组比较,*P<0.05；与AAC模型组比较，#P<0.05

3 讨 论

本研究发现，(1)吴茱萸次碱能显著改善AAC介导的高血压大鼠心肌肥大和心肌炎症反应；(2)吴茱萸次碱能抑制AAC介导的高血压大鼠左心室EGFR和ERK1/2的活化；(3)抑制EGFR能改善AAC介导的高血压大鼠心肌肥大和心肌炎症反应，抑制ERK1/2活化。

EGFR与高血压心肌肥大的发生发展密切相关。靶向敲除平滑肌细胞中EGFR并不能改变小鼠收缩压，但能降低外周血管阻力、舒张压和平均动脉压[6]。我们的研究结果显示，抑制EGFR未能降低AAC介导的高血压大鼠收缩压和舒张压。这说明EGFR活化在生理条件下，能调控外周血管阻力压，但在病理条件下并不能改变血压。课题组前期在原代培养的乳鼠心肌细胞中研究发现，EGFR活化可促进血管紧张Ⅱ介导的心肌肥大[7]。体内研究发现，EGFR抑制剂能显著改善血管紧张素I介导的高血压心肌肥大[8]。此外，心脏局部注射慢病毒包被的EGFR shRNA能显著削弱自发性高血压大鼠心肌肥大[9]。体内研究证据与本研究结果一致：选择性EGFR抑制剂AG1478显著削弱了AAC介导的高血压大鼠左心室肥大。上述研究表明，EGFR是诱导高血压心肌肥大的重要机制，且其调控不依赖血压改变。

ERK1/2在心肌肥大的发生发展中起重要作用。研究表明MEK1通过直接诱导L-苏氨酸-谷氨酸-酪氨酸模序磷酸化而激活ERK1/2。MEK1转基因小鼠模型发现，生理条件下MEK1通过ERK1/2活化诱导代偿性心肌肥大[10]，提示一定程度的ERK1/2活化对维持心肌生理功能的必要性。在胸主动脉缩窄介导的高血压小鼠模型中，ERK2基因敲除可显著削弱高血压心肌肥大[11]，但Nicole HP等[12]报道截然不同的结果：ERK1/2基因抑制并不能抑制胸主动脉缩窄介导的高血压心肌肥大。这种差异可能是由于基因敲除方法不同造成的。研究表明，通过干扰ERK二聚体形成而抑制细胞核内ERK1/2信号通路，从而削弱高血压心肌肥大[13]。因此，ERK1/2长期以来被认为是促高血压心肌肥大的重要蛋白。本研究结果显示，吴茱萸次碱能显著改善AAC介导的高血压大鼠心肌肥大及左心室EGFR、ERK1/2的活化；且抑制EGFR能抑制AAC介导的高血压大鼠心肌肥大及ERK1/2活化。故吴茱萸次碱通过抑制EGFR-ERK1/2通路削弱AAC介导的高血压心肌肥大。

流行病学研究显示，高血压患者循环中C反应蛋白(c-reactive protein，CRP)、IL-1β、IL-6和TNF-α等炎症因子表达水平明显升高，且循环中CRP、IL-6表达与血压水平呈正相关，说明高血压是一个炎症性疾病[14]。在血管紧张素Ⅱ和高盐诱导的高血压小鼠中，IL-6体内敲除可抑制心室功能紊乱、心肌炎症和纤维化[15]。IL-6注射可诱导大鼠左心室肥大，增加室壁硬度和心肌间质胶原容积分数[16]。Lai NC等则报道截然不同的结果：IL-6敲除并不影响胸主动脉缩窄介导的高血压小鼠心室重构[17]。上述结果的差异可能是由于高血压模型和基因敲除的方法不同所导致。TNF-α敲除可抑制血管紧张素Ⅱ和胸主动脉狭窄介导的高血压小鼠心肌肥大和炎症反应，改善心室功能[18-19]。系统敲除IL-1β显著改善了主动脉狭窄介导的高血压心肌肥大[20]。上述研究表明，以IL-1β、IL-6和TNF-α为关键因子的炎症反应是高血压心肌肥大发生发展的重要机制。本研究结果显示，吴茱萸次碱和选择性EGFR抑制剂AG1478均能显著改善AAC介导的高血压大鼠心肌肥大和心肌炎症反应。

综上所述，中药单体药吴茱萸次碱能通过抑制EGFR活化显著改善AAC介导的高血压大鼠心肌肥大，其机制可能与其抑制ERK1/2活化和心肌炎症反应有关。这将为吴茱萸次碱作为高血压心肌肥大的治疗药物提供了进一步的理论依据和实验基础。