衢枳壳总黄酮提取工艺的优化及其抗氧化活性

刘小娟，方月娟，夏道宗，王思为

（1.衢州市妇幼保健院，浙江衢州 324000； 2.浙江中医药大学，浙江杭州 310053； 3.衢州市人民医院，浙江衢州 324000）

常山胡柚是芸香科柑橘属植物柚与甜橙的杂交品种，主要产自浙江省衢州市常山县，为我国特有品种［1］，其干燥未成熟果实于2016 年8 月以“衢枳壳”之名被纳入2015 年版《浙江省中药炮制规范》，可以作为中药使用［2］，在2018 年3 月又被浙江省经济和信息化委员会列入“新浙八味”中药材培育品种名单［3］。衢枳壳性微寒，味苦、辛、酸，具有宽胸理气、止咳化痰、清热解毒、抗氧化等功效，其主要成分是黄酮类、挥发性成分［4-6］，但目前对其报道较少［7］。因此，本实验采用正交试验优化衢枳壳总黄酮提取工艺，并研究其抗氧化活性，以期为该药材开发应用奠定基础。

1 材料

1.1 试剂与药物 衢枳壳购于衢州南孔中药有限公司，经衢州市药品食品检验研究院宋剑锋主任中药师鉴定为正品。DPPH、ABTS 自由基购于美国Sigma-Aldrich 公司；芦丁（纯度95%） 对照品购于上海源叶生物科技有限公司；抗坏血酸购于广东光华化学厂有限公司。冰醋酸、无水乙醇购于国药集团化学试剂有限公司；95%乙醇购于上海凌峰化学试剂有限公司；5% NaNO2、10% Al （NO）3、NaOH 等均为分析纯。

1.2 仪器 FA2004 型电子天平、752 型紫外分光光度计（上海菁海仪器有限公司）；KQ-250DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Mill-Q 型去离子水制备系统（美国Millipore 公司）。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含有量测定 参考文献［8］报道。精密称取95% 芦丁对照品15.0 mg，置于100 mL量瓶中，乙醇溶解定容至0.15 mg／mL，精密吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 至另一量瓶中，30% 乙醇定容至5 mL，加入5% NaNO2溶液0.50 mL，振摇后静置5 min，加入10%Al （NO3）3溶液0.30 mL，振摇后放置6 min，加入1.0 mol／mL NaOH 溶液2.0 mL，30%乙醇定容至10 mL，混合均匀，15 min 后在510 nm 波长处测定吸光度。以芦丁含有量为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A）进行回归，得方程为A＝0.000 8X-0.008 1（R2＝0.999 1），在0～600 μg／mL范围内线性关系良好。

取衢枳壳适量，60 ℃下烘干后粉碎，过40 目筛，精密称取10.00 g，加入一定体积分数乙醇混合均匀后在适当温度下提取一段时间，静置冷却，滤过，置于50 mL 量瓶中，乙醇定容，得到供试品溶液，取1 mL，在510 nm 波长处测定吸光度，计算提取率，公式为提取率＝m1／M×100% （m1为总黄酮质量，M为药材质量），其中m1＝供试液中总黄酮含有量×供试液体积×稀释倍数。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇体积分数 取5 g 衢枳壳，固定料液比为1∶20，在80 ℃下加入60%、65%、70%、75%、80%乙醇提取2 h，结果见图1。由此可知，乙醇体积分数在60%～75%范围内时总黄酮提取率随着其升高而增加，在75% 时最高，为5.68%，但进一步升高时提取率反而逐渐降低。因此，选择70%、75%、80%进行试验。

图1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of total flavonoids

2.2.2 提取时间 取5 g 衢枳壳，加入60%乙醇，固定料液比为1∶20，在80 ℃下提取1、1.5、2、2.5、3 h，结果见图2。由此可知，提取1～2 h 时总黄酮提取率升高不明显；2 h 后提取率升高程度较快，在2.5 h 时最高，为4.74%；进一步延长时提取率升高程度缓慢，甚至有下降趋势，可能与溶剂对总黄酮的溶解达到饱和所致。因此，选择2、2.5、3 h 进行试验。

图2 提取时间对总黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

2.2.3 料液比 取5 g 衢枳壳，加入60% 乙醇，在80 ℃下按料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30提取2 h，结果见图3。由此可知，料液比在1∶10～1∶20 范围内时总黄酮提取率升高程度缓慢；增加至1∶25 时提取率最高，为4.61%；大于1∶25 时提取率略有上升，但程度不明显。因此，选择1∶20、1∶25、1∶30 进行试验。

图3 料液比对总黄酮提取率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

2.2.4 提取温度 取5 g 衢枳壳，加入60%乙醇，固定料液比为1∶20，在60、65、70、75、80、85 ℃下提取2 h，结果见图4。由此可知，初期随着提取温度增加，总黄酮提取率不断升高，在75 ℃时最高；继续增加时提取率不升反降，其原因可能是温度过高导致总黄酮部分被破坏。因此，选择70、75、80 ℃进行试验。

图4 提取温度对总黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

2.3 正交试验 在单因素试验基础上，选择乙醇体积分数（A）、提取时间（B）、料液比（C）、提取温度（D） 作为影响因素，总黄酮提取率（Y）作为评价指标［8］，采用L9（34） 正交表设计试验。因素水平见表1，结果见表2，方差分析见表3。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

由此可知，各因素影响程度依次为料液比（C） ＞提取温度（D） ＞乙醇体积分数（A） ＞提取时间（B），因素C对总黄酮提取率有显著影响（P＜0.05），而其他3 种因素影响不显著（P＞0.05）。结合表2 可知理论最佳组合为A3B1C3D3，但提取温度对提取率无明显影响，而且其过高会对总黄酮造成一定破坏，故选择其为80 ℃ （D2）。最终确定，最优工艺为料液比1∶30，提取温度80 ℃，乙醇体积分数80%，提取时间2 h，总黄酮提取率为6.2%。

表2 试验设计与结果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

2.4 验证试验 称取2 g 衢枳壳，按“2.3”项下优化工艺提取3 次，测得总黄酮提取率分别为6.19%、6.20%、6.23%，平均6.21%，与预测值6.2%接近，表明工艺稳定可靠，重复性好。

2.5 体外抗氧化活性研究

2.5.1 清除DPPH 自由基 参考文献［9-11］报道，并略作调整。精密称取DPPH 自由基20 mg，250 mL 无水乙醇定容至2×10-4mol／L。取不同质量浓度总黄酮溶液各2 mL，在同一具塞管中加入上述DPPH 溶液，振摇混匀，室温避光条件下静置30 min，以无水乙醇为对照，在517 nm 波长处测定其吸光度Aa；取上述DPPH 溶液与等体积（2 mL）无水乙醇的混合液，以及不同质量浓度总黄酮溶液与等体积（2 mL） 无水乙醇的混合液，在517 nm 波长处分别测定吸光度Ac、Ab，计算清除率，公式为清除率＝ ｛ ［1-（Aa-Ab）］／Ac｝ ×100%，并求得IC50，通过Graphpad Prism6 软件进行处理，结果见图5。由此可知，随着总黄酮溶液质量浓度升高，其清除DPPH 自由基的能力逐渐增强，在5～1 000 μg／mL 范围内的清除率由7.58%升至88.537%。

图5 总黄酮对DPPH 自由基的清除能力Fig.5 Scavenging capacity of total flavonoids on DPPH free radical

2.5.2 清除ABTS 自由基 参考文献［12］报道。将ABTS 自由基事先配成0.087 5 mmol／L 溶液，以0.4 mL 70%乙醇为对照品；取不同质量浓度总黄酮溶液0.4 mL，移入3.6 mL 上述溶液中，涡旋混合后置于避光处，10 min 后在734 nm 波长处测定吸光度A734，计算清除率，公式为清除率＝ （1-样品管A734／对照管A734） ×100%，并求得IC50，通过Graphpad Prism6 软件进行处理，结果见图6。由此可知，总黄酮溶液质量浓度在5～1 000 μg／mL 范围内时，对ABTS 自由基的清除率由6.236%升至99.054%，并且从250 μg／mL 开始与维生素C相当。

图6 总黄酮对ABTS 自由基的清除能力Fig.6 Scavenging capacity of total flavonoids on ABTS free radical

3 讨论与结论

本实验在单因素试验基础上，通过正交试验优化衢枳壳总黄酮提取工艺，得到最佳参数为乙醇体积分数80%，料液比1∶30，提取时间2.0 h，提取温度80 ℃，总黄酮提取率达6.21%，而且该方法简便快速，无污染，可避免浸出更多无效成分，有利于进一步分离纯化。优化后，衢枳壳总黄酮提取液对ABTS 自由基的清除能力与维生素C 相当，而对DPPH 自由基的清除率达88.537%，表明其体外抗氧化活性显著，并呈量效依赖关系。

自从2015 年衢枳壳作为中药被纳入《浙江省中药炮制规范》 以来，关于其有效成分及药理作用的文献有所增加［13-15］，但还是偏少，而相关研究可对该药材种植、采栽、炮制方法的确定起到推动作用，促进浙江道地药材资源的保护与开发，并能不断巩固和提高浙江中药品牌的影响力。同时，该药材的抗氧化活性能作为潜在抗氧剂应用于食品和药品中，从而为其综合利用奠定理论基础。

今后，课题组将进一步研究衢枳壳总黄酮与抗氧化有关的药理活性及其作用机制，如改善呼吸道炎症反应、哮喘等，以期将其开发成安全性高、疗效确切的相关药物。