栀子苷、川芎嗪和葛根素配伍对脑缺血再灌注损伤的保护作用

刘 钊，钟菊迎，高尔宁，杨 鸿

（中国中医科学院医学实验中心，北京市中医药防治重大疾病基础研究重点实验室，北京 100700）

缺血性脑血管疾病约占脑血管疾病的80%［1］，其死亡率在人类疾病中居第二位［2］，脑缺血患者恢复血液灌注后脑组织损伤反而加重，出现更严重的功能障碍和结构损伤，称为脑缺血再灌注损伤［3］（ischemia-reperfusion-induced cerebral injury，IRCI），脑缺血组织过量的炎症反应是其重要发病机制［4］。栀子苷、川芎嗪和葛根素具有抑制多种炎性因子释放、毛细血管扩张、白细胞游走等多方面的抗炎作用［5-8］，本实验以三者为对象，对脂多糖引起RAW264.7 细胞过度炎症反应的抑制作用为指标，筛选出最佳配伍，并在大鼠脑缺血再灌注损伤模型、体外凝血实验中验证其保护神经血管单元、改善血液高凝状态的作用。

1 材料

1.1 细胞与动物 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7，购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心；清洁级SD 大鼠，雄性，体质量240～260 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号SCXK （京） 2012-0001。

1.2 试剂与药物 川芎嗪 （纯度99%，批号ZL201304014A）、栀子苷 （纯度 99%，批号ZL201305026A）、葛根素 （纯度 99%，批号ZL201304021A） 对照品购自南京泽朗医药科技有限公司。DMEM 高糖细胞培养基（货号11965092）购自美国Gibco 公司；Hyclone 南美胎牛血清（货号SV30087.01） 购自美国Thermo 公司；磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH ＝7.4，不含微生物和内毒素，货号806552）、脂多糖 （Escherichia ColiO111∶B4，货号L2630） 购自美国Sigma 公司；Bio-Plex ProTMMouse Cytokine 23-plex Assay （货 号M60009RDPD） 购自美国Bio-Rad 公司；四氮唑红（货号30187792） 购自国药集团化学试剂北京有限公司；凝血酶测试试剂盒（货号130105）、凝血活酶（货号130122）、部分凝血活酶（含氯化钙溶液，货号130110） 均购自复旦大学附属华山医院技协生物试剂公司。

1.3 仪器 Bio-Plex 200 液相蛋白芯片分析系统，购自美国Bio-Rad 公司；中药组分优化软件v1.0版，由中国中医科学院中药所杨洪军研究员提供。

2 方法

2.1 药品制备 在超净台中将栀子苷、川芎嗪、葛根素、脂多糖分别溶于高糖DMEM 培养液或PBS 溶液中，配制成1 g／L 或4 g／L，0.2 μm 注射器式过滤器过滤，分装于1.5 mL 离心管中，保存在-80 ℃超低温冰箱中备用。

2.2 中药组分配伍剂量的确定 前期研究表明，栀子苷、川芎嗪、葛根素含有量分别低于400、200、400 g／L 时对细胞无明显毒性。按照水平数应大于因素数2 倍的均匀设计原则，以栀子苷含有量（X1）、川芎嗪含有量（X2）、葛根素含有量（X3）作为考察因素，U9（93） 均匀设计表设置9 个水平，见表1。

表1 栀子苷、川芎嗪和葛根素给药方案Tab.1 Regimens for gardenoside，ligustrazine and puerarin administration

2.3 细胞分组及处理 在37 ℃、5% CO2的培养箱中用含10% 胎牛血清、100 U／mL 青霉素、100 ng／L链霉素的高糖DMEM 培养液培养小鼠单核巨噬细胞RAW264.7，每2～3 d 换液，将细胞分为对照组、LPS 模型组（1 ng／L）、中药组分配伍组。取对数生长期生长状态良好的RAW264.7 细胞进行实验，弃去原有培养液，加入适量高糖DMEM 培养液，反复轻轻吹打制成含1×108／L 细胞的单细胞悬液，24 孔细胞板每孔接种1 mL 细胞悬液，培养24 h。分别向细胞板孔中加入相应配伍混合物，孵育4 h 后再加入LPS （1 ng／L），20 h后收集各组细胞培养上清液，冻存于-80 ℃超低温冰箱中备用。

2.4 细胞因子水平检测 细胞上清液在室温下完全溶解后10 000 r／min 离心10 min，缓冲液按1∶10比例稀释上清液。按照试剂盒说明书，于96孔检测板上每孔加入50 μL 检测磁珠，洗涤2 次，加入缓冲液、标准曲线样品溶液、待检测细胞上清液样品溶液各50 μL，室温避光振荡（500 r／min）后摇床上孵育30 min，洗涤3 次，依次加入检测抗体25 μL、Streptavidin-PE 荧光色素50 μL，操作同上，每孔用125 μL 缓冲液重悬微珠，放入Bio-Plex 200 液相蛋白芯片分析系统中读取中位数荧光强度（median fluorescent intensity，MFI），并根据标准品的荧光强度检测干扰素-γ （IFN-γ）、小鼠角化细胞源性细胞因子（KC）、核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、嗜酸细胞活化趋化因子（Eotaxin）、单巨噬细胞炎性蛋白-1α （MIP-1α）、巨噬细胞炎性蛋白-1β （MIP-1β）、受调节激活的正常T 细胞排泌的因子 （RANTES）、肿瘤坏死因子-α （TNFα）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF） 及白介素类因子IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12 （p40）、IL-12 （p70）、IL-13、IL-17 共23 种细胞因子水平，计算各复方对单个细胞因子的抑制率和对所有细胞因子的综合抑制率，公式为单个细胞因子抑制率＝ ［（模型组细胞因子水平-复方组细胞因子水平）／模型组细胞因子水平］×100%、综合抑制率＝ （16 种细胞因子抑制率之和／16） ×100%。

2.5 对脑缺血再灌注损伤保护作用的研究

2.5.1 分组及给药 适应性喂养3 d 后，45 只清洁级SD 大鼠随机分为假手术组、模型组、预测最佳配伍组（栀子苷∶川芎嗪∶葛根素＝1∶4∶3，24 mg／kg）。手术前3 d 开始，大鼠每天皮下注射给药1 次，假手术、模型组大鼠灌胃给予等体积的PBS 溶液。

2.5.2 模型建立 手术参照Zea Longa1［9］报道的大鼠大脑中动脉内栓线阻断法（MCAO） 并作适当改良。大鼠术前禁食12 h 后用10% 水合氯醛（400 mg／kg） 常规麻醉，分离左侧颈总动脉，并显露分叉处、颈内动脉、颈外动脉，游离颈外动脉，于近心端距分叉处4 mm 切口插入尼龙线，直视下进入颈内动脉，长度约为（18±0.5） mm，直至大脑前动脉近端以完全阻断大脑中动脉血供，缺血4 h再灌注时，轻柔回抽尼龙线至颈外动脉分叉处，恢复大鼠大脑中动脉供血；假手术组只是不插入尼龙鱼线，其余步骤同上。在缺血期间及再灌注后，保持大鼠体温（37±0.5）℃。

2.5.3 神经功能评分 参照Zea Longa［9］报道进行评分。大鼠活动正常未观察到神经功能缺损症状，为0 分；大鼠不能完全伸展脑缺血对侧前肢（轻度），为1 分；大鼠行走时向脑缺血对侧旋转（中度），为2 分；大鼠自主运动时向脑缺血对侧倾倒（重度），为3 分；大鼠不能自发行走，意识水平显著降低（极重度），为4 分。

2.5.4 TTC 染色计算梗死灶与大脑体积比 大鼠于缺血4 h 再灌注20 h 后相应时间点处死，断头取脑，用脑切片器按2 mm 厚度在距额极1、3、5、7 mm处冠状切开大脑，置于2% TTC 中，放入37 ℃温箱中120 min，不时翻动脑片以使其均匀接触到染色液，正常脑组织被染成红色，坏死脑组织无法染色呈灰白色。采用Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统计算梗死面积，将各脑片梗死面积与厚度的乘积进行累加，获得梗死体积，同法计算正常脑组织体积。梗死灶与大脑体积比＝ ［梗死灶体积／（梗死灶体积＋正常脑组织体积）］× 100%。

2.6 体外抗凝血活性测定 实验室条件适应性喂养3 d 后，6 只清洁级SD 大鼠术前禁食12 h，10%水合氯醛常规麻醉后腹腔动脉取血，与3.8%枸橼酸钠液混合（1∶9），3 000 r／min 离心10 min。取上清血浆，在2 h 内进行实验。预测最佳配伍组（栀子苷∶川芎嗪∶葛根素＝1∶4∶3，4 mg／mL）、PBS 溶液组、肝素钠组（100 U／mL） 分别与上清血浆按1∶4 比例混合后，使用半自动凝血仪测定各组的活化部分凝血活酶时间、凝血酶时间、凝血酶原时间。

2.7 统计学分析 利用SPSS 13.0 软件进行处理，数据以（） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05 表示差异具有统计学意义。应用“中药组方优化平台”V1.0 软件，采用多元线性回归算法，获得细胞因子综合抑制率（Y） 与栀子苷含有量（X1）、川芎嗪含有量（X2）、葛根素含有量（X3） 的回归方程。根据以上方程并结合实际进行人工优化，最优配伍组按“2.3”～ “2.4”项下方法进行验证。

3 结果

3.1 配伍对细胞因子水平的影响 在正常RAW264.7 细胞中，各种细胞因子均呈低表达，经LPS 刺激，RAW264.7 细胞表达大量的细胞因子（P＜0.05，P＜0.01），其中MIP-1α、MIP-1β、TNF-α 水平超过了Bio-Plex 200 液相蛋白芯片分析系统能检测到的最高上限。配伍组7 对细胞因子的抑制作用最显著，综合抑制率最高，是唯一同时对IL-2、Eotaxin、IL-9 表达有抑制作用的（P＜0.05，P＜0.01），而配伍组7 能下调IL-1α、IL-4、IL-6、IL-10、GM-CSF、G-CSF、IFN-γ、KC 水平 （P＜0.05，P＜0.01），见表2。另外，配伍组1～9 的综合抑制率分别为27.6%、22.9%、25.5%、23.2%、25.9%、25.4%、40.1%、31.6%、26.9%。

表2 各组RAW264.7 细胞培养上清液中细胞因子水平的比较（ng／L，， n＝3）Tab.2 Comparison of cytokines levels in RAW 264.7 cell culture supernatant among all groups （ng／L，， n＝3）

表2 各组RAW264.7 细胞培养上清液中细胞因子水平的比较（ng／L，， n＝3）Tab.2 Comparison of cytokines levels in RAW 264.7 cell culture supernatant among all groups （ng／L，， n＝3）

注：与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与LPS 模型组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 数据验证 应用中药组分优化软件分析栀子苷、川芎嗪、葛根素含有量与细胞因子综合抑制率（Y） 之间的量效关系，得到回归方程为Y＝0.000 131 625 024 139 952＋0.000 593 434 987 332 954X1＋0.001 709 513 294 915 8X2＋0.000 452 116 715 964 787X3。结合实际进行人工优化，获得预测最佳配伍为栀子苷、川芎嗪、葛根素比例1∶4∶3。按“2.3”～“2.4”项下方法进行验证试验，测得最佳配伍的综合抑制率为31.2%，高于配伍组7 的26.2%，与预期结果一致。

3.3 预测最佳配伍对脑缺血再灌注损伤的保护和体外抗凝血作用 缺血再灌注模型下，假手术组大鼠左右脑均染成红色未见梗死灶，模型组大鼠左脑有明显的灰白色梗死灶，最佳配伍组大鼠左脑灰白色脑梗死体积小于模型组（P＜0.05），各组大鼠右脑均未见灰白色梗死灶，最佳配伍组大鼠神经症状评分优于模型组（P＜0.05） （图1、表3）。在体外抗凝血实验中，与PBS 溶液组相比预测最佳配伍组平均凝血酶原时间、凝血酶时间延长（P＜0.05，P＜0.01），见表4。

图1 TTC 染色观察各组大鼠脑梗死体积变化Fig.1 Observation of cerebral infarction volume change among all groups by TTC staining

表3 各组大鼠脑梗死体积和神经行为评分比较（，n＝15）Tab.3 Comparison of cerebral infarction volumes and neurobehavioral dysfunction scores among all groups （， n＝15）

表3 各组大鼠脑梗死体积和神经行为评分比较（，n＝15）Tab.3 Comparison of cerebral infarction volumes and neurobehavioral dysfunction scores among all groups （， n＝15）

注：与模型组比较，＃P＜0.05。

表4 各组体外血浆凝血酶时间的比较（， n＝3）Tab.4 Comparison of in vitro thromboplastin time among all groups （， n＝3）

表4 各组体外血浆凝血酶时间的比较（， n＝3）Tab.4 Comparison of in vitro thromboplastin time among all groups （， n＝3）

注：与PBS 溶液组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

4 讨论

白细胞在脑缺血区浸润聚集并释放的多种炎性细胞因子、水解酶和活性氧簇所引起过度炎症反应是造成脑缺血再灌注损伤的重要原因，一方面诱发血栓形成造成微血管 “无复流”甚至再次阻断［10-11］；另一方面，破坏血脑屏障会直接损失神经元，造成局部脑组织坏死［12-13］。长期临床及实验研究证实，中药及其有效成分在治疗脑缺血再灌注损伤方面有很好的效果［14-16］，栀子苷、川芎嗪和葛根素具有减少多种炎性相关性因子的合成和释放、抑制白细胞游走和微血管扩张、降低血压、改善血液高凝状态等作用［5-8］。

本研究以栀子苷、川芎嗪和葛根素为考察因素，采用均匀设计表U9 （93） 进行配伍剂量设计，对脂多糖诱导RAW264.7 细胞分泌细胞因子的抑制率为指标，研究三者配伍对白细胞过度炎症反应的抑制作用，发现配伍后可不同程度地降低IL-1α、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12（p40）、IL-12 （p70）、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ、KC、Eotaxin、MCP-1、RANTES 共16 种细胞因子的水平。对实验结果采用综合权重和多元线性回归算法进行分析，结合人工优化，筛选并验证出栀子苷、川芎嗪和葛根素最佳配伍比例为1∶4∶3，可通过降低白细胞释放，从而减少了T 细胞的活化、B 细胞的成熟、嗜酸性粒细胞和自然杀伤细胞的增殖，降低了抗体、前细胞因子、淋巴因子、急性期反应蛋白表达，抑制了单核细胞、巨噬细胞、粒细胞的趋化活性，减轻了缺血区的过度炎症反应；通过抑制凝血因子活性来减少血栓形成，从而改善了微血管堵塞情况；通过保护脑缺血后恢复血流供应的MCAO 大鼠的神经血管单元，从而减少了大脑梗死面积，提高了其生存质量。

综上所述，栀子苷、川芎嗪和葛根素合理配伍后能有效增强各组分降低炎症级联反应、促进脑部血流恢复的协同作用，从而保护了大脑血管神经单元，减少了大脑半暗带神经组织的损伤，促进了神经功能的修复。今后，将对配伍协同增效的机制及其基因之间的相互联系、相互作用等作进一步研究，可有助于提高栀子苷、川芎嗪和葛根素的疗效，使三者更好地服务于临床。