花鹿茸切制工艺的优化

单国顺，赵启苗，臧彬如，高 慧，张 凡，贾天柱*

（1.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600； 2.辽宁中医药大学杏林学院，辽宁沈阳 110167）

鹿茸为鹿科动物梅花鹿Cervus nipponTemminck或马鹿Cervus elaphusLinnaeus 的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，前者习称“花鹿茸”，后者习称“马鹿茸”，其味甘、咸，性温，归肾、肝经，具有壮肾阳、益精血、强筋骨、调冲任、托疮毒的功效，多用于肾阳不住、精血亏虚、阳痿滑精、宫冷不孕、羸瘦、神疲、眩晕、耳鸣等症，被列入“东北三宝”之一［1-4］，多以薄片使用，但长期以来有关其切制工艺的研究却鲜有报道。因此，为了规范花鹿茸切制工艺，保证饮片质量和临床疗效，本研究以其主要活性成分为指标，采用单因素试验结合正交试验对其切制工艺进行优化。

1 材料

UV-T6 紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；KQ-250DB 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；AE240 分析天平（十万分之一，瑞士 Mettler-Toledo 公司）；FA1004B 电子天平 （上海精密科学仪器有限公司）；X／WT 数显调节仪电热恒温水浴锅（余姚市显星仪器有限公司）。葡萄糖对照品 （批号wkq16082202，四川省维克奇生物科技有限公司）；牛血清白蛋白（批号S91139，北京索莱宝科技有限公司）；甘氨酸（批号DST180603-134，成都德思特生物技术有限公司）；考马斯亮蓝G-250 （批号K18443，优级纯，北京索莱宝科技有限公司）；茚三酮（批号D1111A，优级纯，大连美仑生物技术有限公司）；3，5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、盐酸、丙三醇、异丙醇、醋酸钠、乙酸、酚酞均为分析纯；水为纯净水。

花鹿茸购自辽宁贵金生物医药有限公司，批号20180505001，经辽宁中医药大学中药鉴定教研室李峰教授鉴定为鹿科动物梅花鹿Cervus nipponTemminck 的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。

2 方法与结果

2.1 总糖含有量测定

2.1.1 对照品溶液制备 取葡萄糖对照品约503.9 mg，精密称定，少量水溶解并定容于10 mL量瓶中，制成50.39 mg／mL，即得，置于4 ℃冰箱中保存，用时以水稀释至0.503 9 mg／mL。

2.1.2 供试品溶液制备 取花鹿茸片（3 号筛）粉末约1.0 g，精密称定，置于100 mL 锥形瓶中，加浓盐酸20 mL、蒸馏水30 mL，沸水煮60 min，滤过，加1 滴酚酞试剂，10%NaOH 溶液中和至微红色，定容于100 mL 量瓶中，混匀，即得。

2.1.3 线性关系考察 精密量取0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL对照品溶液，加水定容至1.0 mL，加入1.5 mL DNS 试剂，充分混匀后沸水浴加热5 min，流水冷却后再向各试管中加入4 mL 蒸馏水，混匀，测定500 nm波长处吸光度。以葡萄糖含有量为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A） 进行回归［5-9］，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.1.4 精密度试验 精密吸取“2.1.2”项下供试品溶液0.5 mL，按“2.1.3”项下方法测定，测得吸光度RSD 为0.91%，表明仪器精密度良好。

2.1.5 重复性试验 取同一花鹿茸粉末6 份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下方法测定，测得总糖含有量RSD 为2.71%，表明该方法重复性良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一供试品溶液1.0 mL，显色后于0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h 按“2.1.3”项下方法测定吸光度，测得其RSD 为2.46%，表明溶液在显色后4 h 内稳定性良好。

2.1.7 加样回收率试验 取6 份总糖含有量已知的花鹿茸粉末各0.5 g，加入适量对照品溶液，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.3”项下方法测定吸光度，计算回收率，结果见表2。

表2 总糖加样回收率试验结果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for total sugar （n＝6）

2.2 水溶性蛋白含有量测定

2.2.1 对照品溶液制备 取牛血清白蛋白（BSA）约200.0 mg，精密称定，少量蒸馏水溶解并定容于10 mL 量瓶中，制成20.0 mg／mL，即得，置于4 ℃冰箱中保存，用时以水稀释至0.2 mg／mL。

2.2.2 供试品溶液制备 取花鹿茸片（3 号筛）粉末约1.0 g，精密称定，置于50 mL 锥形瓶中，加20 mL 水，超声（250 W、50 Hz） 处理10 min，重复3 次，合并提取液，离心后用水定容至100 mL，混匀，即得。

2.2.3 线性关系考察 精密量取0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL 对照品溶液，加水定容至0.5 mL，摇匀，加入考马斯亮蓝G-250 染色液5 mL进行染色，反应5 min 后测定595 nm 波长处吸光度。以BSA 含有量为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A） 进行回归［9-11］，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.2.4 精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下供试品溶液0.5 mL，按“2.2.3”项下方法测定，测得吸光度RSD 为1.53%，表明仪器精密度良好。

2.2.5 重复性试验 取同一花鹿茸粉末6 份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下方法测定，测得水溶性蛋白含有量RSD 为2.18%，表明该方法重复性良好。

2.2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液1.0 mL，显色后于0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h 按“2.2.3”项下方法测定吸光度，测得其RSD 为2.38%，表明溶液在显色后4 h内稳定性良好。

2.2.7 加样回收率试验 取6 份水溶性蛋白含有量已知的花鹿茸样品粉末各0.5 g，加入适量对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.3”项下方法测定吸光度，计算回收率，结果见表3。

表3 总水溶性蛋白加样回收率试验结果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for water-solubility protein（n＝6）

2.3 总游离氨基酸含有量测定

2.3.1 对照品溶液制备 取甘氨酸对照品约125 mg，精密称定，置于25 mL 量瓶中，加水溶解，定容至5.05 mg／mL，即得，置于4 ℃冰箱中保存，用时以水稀释至0.050 5 mg／mL。

2.3.2 供试品溶液制备 按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3.3 线性关系考察 精密量取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 对照品溶液，置于25 mL 比色管中，加水补足1.0 mL，依次加入磷酸盐缓冲液（pH 8.0） 0.5 mL、2% 茚三酮溶液0.5 mL，沸水浴加热10 min 后取出，冷却至室温，加水定容至刻度，摇匀，测定570 nm 波长处吸光度。以甘氨酸含有量为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A）进行回归［12-13］，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.4 精密度试验 精密吸取“2.3.2”项下供试品溶液1.0 mL，按“2.3.3”项下方法测定吸光度，测得其RSD 为0.20%，表明该方法精密度良好。

2.3.5 重复性试验 取同一花鹿茸粉末6 份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下方法测定吸光度，测得总游离氨基酸含有量RSD 为4.63%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 稳定性试验 取同一供试品溶液1.0 mL，显色后于0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 h 按“2.3.3”项下方法测定吸光度，测得其RSD 为2.02%，表明溶液在显色后4 h 内稳定性良好。

2.3.7 加样回收率试验 取6 份总游离氨基酸含有量已知的花鹿茸粉末各0.50 g，加入适量对照品溶液，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下方法测定吸光度，计算回收率，结果见表4。

表4 总游离氨基酸加样回收率试验结果（n＝6）Tab.4 Results of recovery tests for total free amino acid（n＝6）

2.4 单因素试验

2.4.1 去毛方式 选取3 根未去毛花鹿茸，以茸体外观性状为指标，对刮去毛、火燎去毛、火燎后再刮去毛3 种去毛方法进行比较。由表5 可知，火燎后再刮去毛可以更好地去净茸体表面的毛，而且简便易行。

表5 去毛方式单因素Tab.5 Single factors of hair remover method

2.4.2 润制［2］

2.4.2.1 乙醇体积分数考察 选取4 段相同规格的去毛花鹿茸，称定质量，从锯口分别加入40%、50%、60%、70%乙醇进行润制，润透后切片，阴干，以润制时间和干燥时间为指标，确定合适的乙醇浓度。由表6 可知，花鹿茸润制以60% 乙醇较合适。

表6 乙醇体积分数单因素Tab.6 Single factors of ethanol concentration

2.4.2.2 加酒量考察 选取4 段相同规格的去毛花鹿茸，称定质量，以润制程度为指标，按照它与白酒（60%乙醇） 1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶3 的比例，从锯口加入白酒进行润制。由表7 可知，加酒量以1∶1 较为合适。

表7 加酒量单因素Tab.7 Single factors of wine addition

2.4.2.3 润制时间考察 选取4 段相同规格的去毛花鹿茸段，按照它与白酒1∶1 的比例，以润制程度为指标，分别考察润制5、6、7、8 h 时的效果。由表8 可知，润制时间以6 h 较为合适。

表8 润制时间单因素Tab.8 Single factors of moistening time

2.4.3 蒸制 选取4 段相同规格的去毛花鹿茸段，以软化程度为指标，考察蒸制0、1、5、10 min 的蒸制效果。由表9 可知，蒸制时间以1 min 较为合适。

表9 蒸制时间单因素Tab.9 Single factors of steaming time

2.5 正交试验 根据前期文献调研及单因素试验结果，选取乙醇体积分数（A）、润制时间（B）、蒸制时间（C）、干燥方式（D） 作为影响因素，每个因素3 个水平，选用L9（34） 正交表设计试验，因素水平见表10。

表10 因素水平Tab.10 Factors and levels

2.6 正交试验结果 取规格一致的去毛花鹿茸段，按照表10 进行试验，测定总糖、水溶性蛋白、总游离氨基酸含有量，平行2 次。

根据各成分功效设计权重，综合评分T＝M×30／总糖最高含有量＋N×40／总蛋白最高含有量＋O×30／总氨基酸最高含有量，其中，M为总糖含有量，N为水溶性蛋白含有量，O为总游离氨基酸含有量。结果见表11，方差分析见表12。

由此可知，各因素影响程度依次为C＞B＞D＞A，即蒸制时间＞润制时间＞干燥温方式＞乙醇体积分数，初步确定最优切制工艺为A2B3C1D2，即花鹿茸以50%乙醇润制7 h 后，常压蒸制1 min，并采用低温烘干的方式进行干燥。

表11 试验设计与结果Tab.11 Design and results of tests

表12 方差分析Tab.12 Analysis of variance

由于白酒中乙醇体积分数具有显著影响，而润制时间、蒸制时间、干燥方式具有极显著影响。因此，最终确定为花鹿茸经火燎后再用竹片刮去毛，含50%乙醇的白酒与其比例为1∶1 润制7 h 后，常压蒸制1 min，并采用低温烘干的方式进行干燥。

2.7 验证试验 选取3 段相同规格的花鹿茸段，以优化工艺进行切制，并按“2.1”“2.2”“2.3”项下方法制备供试品溶液并测定，结果见表13。

表13 验证试验结果（n＝3）Tab.13 Results of verification tests （n＝3）

由此可知，3 份样品中总糖、水溶性蛋白、总游离氨基酸含有量均较高，综合评分均大于95，表明该工艺切实可行。

3 讨论

3.1 指标成分及测定方法选择 研究表明，花鹿茸中的水溶性蛋白质、多肽、糖类及氨基酸成分是其主要活性物质［14-17］。因此，本研究选取总糖、水溶性蛋白、总游离氨基酸作为指标，用于花鹿茸切制工艺的优化研究。

花鹿茸中含有黏多糖、硫酸软骨素、酸性多糖等多种活性多糖，为了对该类物质进行测定，本研究选择了3，5-二硝基水杨酸比色法，并在相关研究［5-9］的基础上进行优化，发现该方法准确可行。花鹿茸中蛋白质种类繁多丰富，并且具有重要的生物活性，是其水溶性成分中的重要部分，本研究选择了经典的考马斯亮蓝染色法用于其含有量测定［9-11］。花鹿茸中氨基酸含有量丰富，包含多种人体必需者，本研究参考GB／T 8314-2013 茶中游离氨基酸总量测定的方法，建立了该成分检测手段［12-13］，发现其稳定可行。

3.2 工艺优化 本研究通过单因素试验初步确定了花鹿茸切制较为适宜的因素水平范围后，进一步在正交试验中选择了总糖、水溶性蛋白、总游离氨基酸作为指标，白酒中乙醇体积分数、润制时间、蒸制时间、干燥方式作为影响因素进行优化。结果，最优切制工艺为花鹿茸去毛后经锯口按1∶1的比例加入白酒 （50% 乙醇） 润制7 h，蒸制1 min，趁热横切为厚度1～2 mm 的薄片，平铺于烘盘上，上覆吸水纸并压以重物，50 ℃下烘干，该工艺切实可行，既可保证饮片质量和疗效，又能为其工业化生产提供数据支持。

鉴于花鹿茸不同部位中有效成分含有量的差异较大，本研究仅选择血片至红粉片进行考察。今后，将对花鹿茸其他部位的切制工艺开展进一步研究。