穿龙薯蓣根茎中薯蓣皂苷元的制备

龙香丽 梁清延高 宏Anatoly Politov李彦生陈美玲

（1.大连交通大学材料科学与工程学院，辽宁大连 116028； 2.广西玉柴机器配件制造有限公司，广西玉林 537000）

薯蓣科植物在全世界有9 个属、650 多个品种，其中薯蓣属就有600 种左右，主要分布在东南亚、南美等热带、亚热带地区［1-2］。我国薯蓣资源丰富，该属植物约有50 种，主要分布于陕西、江西、湖北、湖南、四川、云南、贵州、广州等地［3］，东北地区及内蒙故也有分布，最早记载见于《山海经》，宋代、明代、清代等均有使用记载［4］。其中，穿龙薯蓣Dioscorea nipponicaMakino 对气候、土壤的要求低，种植广泛。

穿龙薯蓣根茎中皂苷含有量较高，是生产薯蓣皂苷、皂苷元的主要原材料之一［5］，我国是提供薯蓣皂苷元的最大供应商，每年产量约为5 000 吨［6］。现阶段薯蓣皂苷元生产工艺主要是传统的先水解后提取的Rothrok 法，以及先提取后水解的Marker 法［7-8］，但前者对酸需求量大，污染严重，而后者对溶剂需求量大，回收成本高，均存在一定局限性，会破坏环境［9-10］。本实验采用薯蓣皂苷水分离法，先分离出纤维和淀粉作为附属资源，并对皂苷浆料进行富集浓缩（实验室自主研发的工艺，富集率高达98%以上），再经高温高压水解制备皂苷元，不仅在分离阶段即实现无溶剂提取，附属资源得以回收，且在水解阶段减少酸用量，缩短酸解时间，从而降低制备成本。

1 材料

1.1 药材 穿龙薯蓣根茎干片由广东阳江生物科技有限公司提供，经广东阳江生物科技有限公司郭高工程师鉴定为正品，表皮呈褐色，根须较少。

1.2 试剂与药物 薯蓣皂苷元对照品（中国食品药品检定研究院，批号111539-200001）。乙腈为色谱纯（上海阿达玛斯试剂有限公司）；石油醚（60～90 ℃）、浓硫酸、高氯酸、甲醇、香荚兰醛等均为分析纯；水为蒸馏水和超纯水（自制）。

1.3 仪器 FA-JA 型电子天平（上海精科仪器有限公司）；DHG-9040 型真空干燥箱 （上海琦互仪器有限公司）；TGL-10B型离心机（上海安亭科学仪器厂）；DF-101S 型恒温水浴锅（郑州生化仪器有限公司）；JYL-Y925 型破壁机（九阳豆业有限公司）；ZNHW1 000 mL 型恒温电热套（上海羌强实业发展有限公司）；S212-2 L 型高压反应釜（上海森闯仪器有限公司）；UV-9600 型紫外／可见分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司）；LC-20AT 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；索氏提取器。

2 方法

2.1 工艺流程 称取100 g 穿龙薯蓣根茎干片于烧杯中，加入适量蒸馏水使其在液面以下，浸泡4 h 后取出，置于破壁机中，加入400 mL 蒸馏水，10 000 r／min 打浆，筛网过滤浆液，残渣用蒸馏水洗涤后再次倒入筛网中过滤，洗涤得到纤维，滤液静置20 min 后倒出上层液，收集容器底部沉淀，洗涤后得到淀粉。合并洗涤液和倒出的上层液作为悬浊液，对其进行处理，再次分离出部分淀粉，合并、富集悬浊液，得到薯蓣皂苷浆料，将其置于反应釜中进行高温高压水解，过滤并洗涤酸解物至中性，加入石油醚，索氏提取器（80 ℃） 提取6 h，结晶，即得薯蓣皂苷元。

2.2 检测方法

2.2.1 分光光度法 参考文献［11-12］报道测定纤维、淀粉中薯蓣皂苷元含有量。称取105 ℃干燥至恒重的薯蓣皂苷元对照品4.3 mg 于25 mL 量瓶中，甲醇定容，作为对照品溶液，精密吸取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mL对照品溶液于10 mL 试管中，80 ℃水浴挥去溶剂，分别加入新配制的0.2 mL 5%香夹兰醛冰醋酸溶液和0.8 mL 高氯酸，摇匀，置于70 ℃水浴中反应15 min，冰水冷却后加冰醋酸定容至10 mL，加盖放置30 min，在457 nm 波长处测定吸光度。以溶液质量浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（A） 进行回归，得方程为A＝21.022X-0.007 8 （R2＝0.995 4），在1.72～18.92 mg／L 范围内线性关系良好。将石油醚提取液于70 ℃水浴中挥发至干，甲醇溶解后定容于200 mL 量瓶中，精密吸取0.2 mL 于10 mL 试管中，80 ℃水浴挥去溶剂。加入新配制的0.2 mL 5%香夹兰醛冰醋酸溶液和0.8 mL 高氯酸，摇匀，置于70 ℃水浴中反应15 min，冰水冷却后加冰醋酸定容至10 mL，加盖放置30 min，在457 nm 处测定其吸光度，将其代入回归方程中得到皂苷元质量浓度，再换算成皂苷元含有量。

2.2.2 HPLC 法 参考文献［13-14］报道测定皂苷元纯度。

2.2.2.1 色谱条件 All-tima C18色谱柱 （150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈-水 （90∶10）；体积流量1 mL／min；柱温30 ℃；检测波长208 nm。

2.2.2.2 对照品溶液制备 精密称取薯蓣皂苷元对照品10 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇溶解，即得（每1 mL 含0.4 mg 该成分）。

2.2.2.3 供试品溶液制备 精密称取皂苷元5 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解，即得 （每1 mL 含0.2 mg 该成分）。

2.2.2.4 线性关系考察 取对照品溶液0.5、1.25、2.5、3.75、5、6.25 mL，置于10 mL 量瓶中，在“2.2.2.1”项色谱条件下进样测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归，得方程为Y＝0.136 6X＋44.658 （r＝0.999 3），在100～2 500 μg／mL 范围内线性关系良好。

3 结果

3.1 薯蓣皂苷分离

3.1.1 破壁时间对薯蓣皂苷元损失率的影响 图1 显示，当破壁时间为20 s 时效果不佳，浆料中残留有块状根茎，过筛时进入纤维中，导致薯蓣皂苷严重损失；延长至40 s时薯蓣根茎已基本破壁，薯蓣皂苷元损失率仅为0.08%；继续延长时，该成分损失率降低程度不明显，而且纤维分离量不断减少。因此，确定破壁时间为40 s。

图1 破壁时间对薯蓣皂苷元损失率的影响

3.1.2 筛网目数对薯蓣皂苷元损失率的影响 图2 显示，当筛网目数≥300 目时薯蓣皂苷元损失率增加程度较缓慢；在400 目时该成分损失率迅速增加，达0.44%，其原因是筛网目数过小时部分被纤维包裹的薯蓣皂苷残留在纤维中而造成损失。考虑到纤维过滤难易程度、滤液中纤维含有量、后期水解时酸用量，确定筛网目数为200 目。

3.1.3 纤维洗涤次数对薯蓣皂苷元损失率的影响 表1 显示，纤维洗涤6 次后分离得到的纤维量仅有8%，再测定薯蓣皂苷元含有量，结果见图3。由此可知，随着纤维洗涤次数增加，纤维中薯蓣皂苷元含有量不断减少，损失率不断降低，洗涤3 次时损失率仅为0.06%，继续洗涤时变化较小。综合考虑用水量及后续处理量，确定纤维洗涤次数为3 次，纤维量为18%。

图2 筛网目数对薯蓣皂苷元损失率的影响

表1 纤维洗涤次数对纤维量的影响

3.1.4 淀粉洗涤次数对薯蓣皂苷元损失率的影响 表2 显示，淀粉洗涤3 次后淀粉量为24%，再测定薯蓣皂苷元含有量，结果见图4。由此可知，随着淀粉洗涤次数增加，淀粉中薯蓣皂苷元含有量不断减少。损失率不断降低，洗涤3 次时几乎检测不到该成分。因此，确定淀粉洗涤次数为3 次，淀粉量为24%。

表2 淀粉洗涤次数对淀粉量的影响

3.2 薯蓣皂苷元制备 将调节好硫酸浓度的薯蓣皂苷浆料从高温高压反应釜的进料口倾入釜中，关闭进料阀，并确定其他阀门处于关闭状态，加压至2 MPa （经优化得到），打开搅拌开关，设置好水解保温时间和水解保温温度后进行水解。反应结束后，将料液从出料口放出，水解过程可使薯蓣皂苷糖基脱落生成而薯蓣皂苷元。

图4 淀粉洗涤次数对薯蓣皂苷元含有量及损失率的影响

3.2.1 硫酸浓度对薯蓣皂苷元收率的影响 图5 显示，随着硫酸浓度增加，薯蓣皂苷元收率呈先升后降的趋势，在1 mol／L 时最高，达 3.04%。因此，确定硫酸浓度为1 mol／L。

图5 硫酸浓度对薯蓣皂苷元收率的影响

3.2.2 保温时间对薯蓣皂苷元收率的影响 图6 显示，随着保温时间延长，薯蓣皂苷元收率呈先升后降的趋势，在60 min 时水解较充分，但继续延长后该成分出现分解，导致收率反而下降。因此，确定保温时间为60 min。

图6 保温时间对薯蓣皂苷元收率的影响

3.2.3 保温温度对薯蓣皂苷元收率的影响 图7 显示，随着保温温度增加，薯蓣皂苷元收率呈先升后降的趋势，在130 ℃时水解较充分，但继续升高后该成分出现分解，导致收率反而下降。因此，确定保温温度为130 ℃。

图7 保温温度对薯蓣皂苷元收率的影响

3.2.4 正交试验 在单因素试验基础上，选择保温时间（A）、硫酸浓度（B）、保温温度（C） 作为影响因素，薯蓣皂苷元收率（Y） 作为评价指标，正交试验优化水解工艺，因素水平见表3，结果见表4。由此可知，各因素影响程度依次为保温时间＞硫酸浓度＞保温温度，最优工艺为A2B2C2，即保温时间60 min，硫酸浓度1 mol／L，保温温度130 ℃。

表3 因素水平

表4 试验设计与结果

取穿龙薯蓣根茎100 g，浸泡4 h 后取出，置于破壁机中，加入400 mL 水破壁40 s，200 目筛网过滤，纤维、淀粉各洗涤3 次，合并洗涤液、滤液，富集浓缩后得到薯蓣皂苷浆料，用硫酸将其配制成1 mol／L 料液，置于高温高压反应釜中，在特定压力下不断搅拌，130 ℃下保温60 min，水解料液过滤、洗涤至中性，105 ℃下干燥后打包，80 ℃下石油醚索氏提取6 h，结晶得到薯蓣皂苷元，进行3 批验证试验，结果见表5，可知该成分纯度符合行业要求（≥95%）。

表5 验证试验结果（， n＝3）

表5 验证试验结果（， n＝3）

4 讨论与结论

本实验通过单因素试验结合正交试验，得到穿龙薯蓣根茎中薯蓣皂苷元的最优分离工艺为破壁时间40 s，筛网目数200 目，纤维洗涤次数3 次，淀粉洗涤次数3 次；最优水解工艺为保温时间60 min，硫酸浓度1 mol／L，保温温度130 ℃，该成分收率为3.07%，纯度为96.25%，符合行业相关要求。

由于国家对环境保护的要求日益严格，薯蓣皂苷元产业正面临着转型升级，开发绿色节能的制备工艺迫在眉睫。本实验通过水分离出薯蓣皂苷浆料后再进行高温高压水解，不仅可无溶剂提取，附属资源得以回收，而且能降低后续水解酸用量，缩短保温时间，节约制备成本。今后，将致力于开发不使用有机溶剂的薯蓣皂苷元绿色分离工艺。