雷公藤甲素配伍芍药苷对L-02 细胞毒性的影响*

肖芳

（南昌大学第四附属医院 江西南昌330003）

雷公藤甲素（Triptolide,TP）是雷公藤的主要成分之一，具有显著的免疫抑制和抗炎镇痛作用，但它的毒性很强，急性中毒主要表现为肝损伤和胃肠道毒性，长期毒性表现为抑制骨髓，损害心脏、肾脏等器官[1～2]。白芍，苦、酸，微寒。归肝、脾经，具有敛阴柔肝、缓急止痛的作用。现代研究表明，白芍具有护肝和调节免疫的作用，《中华本草》中记载白芍具有抗炎和调节免疫的作用。有研究表明，白芍可对抗雷公藤多苷造成的小鼠急性肝损伤，降低血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）及丙二醛（MDA）含量，提高机体抗氧化能力[3～4]。本研究以正常人肝细胞L-02 细胞为模型研究TP 配伍芍药苷对L-02 细胞毒性的影响。现报道如下：

1 材料

SW-CJ-2F 双人双面超净工作台（苏州净化设备有限公司），L-02 细胞（购于中科院上海细胞库），噻唑兰（MTT，北京索来宝有限公司），酶标仪（Thermo公司），96 孔细胞培养板（赛默飞世尓生物化学制品有限公司），雷公藤甲素对照品（成都普菲德生物科技有限公司，批号：20150813，纯度≥98%）；芍药苷对照品（成都普菲德生物科技有限公司，批号：16011402，纯度纯度≥90%）。

2 方法

2.1 细胞培养 将L-02 细胞置于常规培养皿内，以高糖DMEM 培养基（含10%胎牛血清）在37℃、5%二氧化碳（CO2）和相对湿度90%的培养箱内培养，取对数生长期L-02 细胞，弃去原有培养液，用胰蛋白酶消化，将细胞均匀种于96 孔板上，所用细胞密度为 5×104个 /ml，每孔 200 μl，每个浓度设置 6个复孔，分别设空白，阴性和8 个浓度，96 孔板最外圈加 200 μl 无钙镁的 D-Hanks 缓冲液（HBSS）进行液封。细胞种板完后放于细胞孵育箱中培养24 h。

2.2 药物溶液的配制

2.2.1 TP 溶液的配制 先用二甲基亚砜（DMSO）将TP 粉末溶解，再用培养液配制成20 μg/ml 的TP溶液（容量瓶要先加一部分水浴加热好的培养液，且稀释的整个过程中容量瓶均要放于水浴锅中预热，防止药物析出）。以20 μg/ml 的TP 母液逐级稀释成以下浓度：200.000 0 ng/ml，100.000 0 ng/ml，50.000 0 ng/ml，25.000 0 ng/ml，12.500 0 ng/ml，6.250 0 ng/ml，3.125 0 ng/ml，1.562 5 ng/ml。

2.2.2 芍药苷溶液的配制 精密称取10 mg 芍药苷置于10 ml 容量瓶中，加入培养液适量，超声2 min 使溶解，并定容至刻度，配成1 mg/ml 的母液。母液逐级稀释成以下浓度：1 000.0 μg/ml，500.0 μg/ml，250.0 μg/ml，100.0 μg/ml，50.0 μg/ml，25.0 μg/ml，12.5 μg/ml。

2.2.3 TP、 芍药苷配伍溶液的配制 将TP 与芍药苷分别以 1:100，1:500，1:1 000，1:2 000 的比例配成以下浓度的溶液：200.000 0 ng/ml，100.000 0 ng/ml，50.000 0 ng/ml，25.000 0 ng/ml，12.500 0 ng/ml，6.250 0 ng/ml，3.125 0 ng/ml，1.562 5 ng/ml。

2.3 MTT 法测定L-02 细胞毒性 将培养24 h 的细胞取出，吸去培养液，用HBSS 液清洗2 遍后，分别加入上述配制不同浓度的药物溶液，每个浓度设6 个复孔，空白和阴性组加入空白培养液，加入置于培养箱中继续培养24 h；取出，吸去药物溶液，用HBSS 液清洗 1 遍后，每个孔加入 20 μl 的 MTT 溶液，置于培养箱中继续培养4 h；取出，吸去MTT 溶液，加入200 μl DMSO 溶液，在微型振荡器上振荡10 min。设置酶标仪的吸收波长为490 nm 测定各样品吸光度。细胞存活率=（OD 试验组－OD 阴性组）/（OD 阴性组－OD 空白组）×100%，其中OD 值为各组的吸光度值。

3 结果

3.1 TP 对L-02 细胞毒性的影响 TP 在12.500 0～200.000 0 ng/ml 的浓度范围内细胞存活率均＜90%，且随浓度的增加，其细胞存活率越小，说明TP在12.500 0～200.000 0 ng/ml 的浓度范围内对L-02细胞存在毒性。见表1。

表 1 TP 对 L-02 细胞毒性的影响（n=6，）

表 1 TP 对 L-02 细胞毒性的影响（n=6，）

组别 OD 值 细胞存活率（%）空白阴性200.000 0 ng/ml TP 溶液100.000 0 ng/ml TP 溶液50.000 0 ng/ml TP 溶液25.000 0 ng/ml TP 溶液12.500 0 ng/ml TP 溶液6.250 0 ng/ml TP 溶液3.125 0 ng/ml TP 溶液1.562 5 ng/ml TP 溶液0.069±0.008 0.470±0.019 0.339±0.030 0.379±0.030 0.367±0.044 0.326±0.021 0.334±0.022 0.470±0.037 0.511±0.044 0.467±0.038-100.000 67.371 77.222 74.221 64.004 66.082 99.958 98.181 99.127

3.2 芍药苷对L-02 细胞毒性的影响 芍药苷在12.5～1 000.0 μg/ml 的浓度范围内，L-02 细胞的存活率均＞90%，表明芍药苷在此浓度范围内对L-02 肝细胞不产生毒性。见表2。

表2 芍药苷对L-02 细胞毒性的影响（n=6，）

表2 芍药苷对L-02 细胞毒性的影响（n=6，）

组别 OD 值 细胞存活率（%）空白阴性1 000.0 μg/ml 芍药苷溶液500.0 μg/ml 芍药苷溶液250.0 μg/ml 芍药苷溶液100.0 μg/ml 芍药苷溶液50.0 μg/ml 芍药苷溶液25.0 μg/ml 芍药苷溶液12.5 μg/ml 芍药苷溶液0.066±0.006 1.206±0.122 1.260±0.074 1.270±0.089 1.355±0.165 1.278±0.110 1.359±0.099 1.456±0.152 1.286±0.056-100.000 99.461 100.631 107.654 101.081 107.481 100.385 99.494

3.3 TP 配伍芍药苷溶液对L-02 细胞毒性的影响当TP 与芍药苷1:100 和1:500 的比例配伍时，对细胞的存活率均无影响，当TP 与芍药苷以1:1 000 的比例配伍后可明显增加L-02 细胞的存活率，且均＞90%，说明雷公藤甲素与芍药苷以1:1 000 的比例配伍能降低雷公甲素对L-02 细胞的毒性作用。见表3。

表3 TP 配伍芍药苷溶液对L-02 细胞毒性的影响（n=6）

4 讨论

本实验采用MTT 法研究了TP，芍药苷，TP 与芍药苷不同比例配伍溶液对L-02 细胞毒性的影响，实验结果发现，TP 对L-02 细胞的无毒范围在6.250 0 ng/ml 以下，芍药苷的L-02 细胞无毒范围在1 000.0 μg/ml 以下，当TP 与芍药苷以1:1 000 的比例配伍时，TP 对L-02 细胞的无毒范围在200.000 0 ng/ml以下，当TP 与芍药苷以1:2 000 的比例配伍时，TP对L-02 细胞的无毒范围在12.500 0 ng/ml 以下。说明TP 与芍药苷以1:1000 的比例配伍时，可降低TP对L-02 细胞的毒性作用，明显减轻TP 对L-02 细胞的损伤，提高细胞存活率。该结果为临床上减毒增效，合理应用雷公藤提供了参考。

以往研究表明，TP 诱导L-02 凋亡是通过降低细胞中超氧化物歧化酶，破坏细胞内的抗氧化防御体系，使得细胞中的活性氧（ROS）相应地增多，从而增加细胞损伤作用[5]。芍药苷降低TP 对L-02 细胞的毒性作用是否跟其能抑制细胞氧化有关及其具体作用机理都有待后期研究探索。