高压脉冲电场辅助提取紫薯酒渣花色苷

马懿 ，陈晓姣，古丽珍，包文川

1.四川轻化工大学生物工程学院（自贡 643000）；2.固态发酵资源利用四川省重点实验室（宜宾 644000）

花色苷属于天然的水溶性色素，其广泛存在于水果、蔬菜等植物中，具有抗氧化、抗癌、抗心血管疾病等诸多生物学活性[1-3]。因此，花色苷资源的开发利用具有重要的科学价值。紫薯作为一类重要谷物和食品加工材料，富含大量花色苷等营养成分。Clifford[4]研究发现紫薯花色苷含量明显高于黑米、蓝莓、草莓、紫甘蓝、葡萄皮。相关研究还发现，利用紫薯为主要原料生产的紫薯酒具有比葡萄酒更高的抗氧化活性[5]。这对于加速紫薯产业的发展奠定较好的理论基础。紫薯酒在日本成为畅销产品[6]。然而，以紫薯为原料生产紫薯酒过程中必然产生大量富含花色苷的紫薯酒渣副产物。这些副产物仅被用于饲料喂养或植物肥料，利用率较低，经济价值不高。因此，将紫薯酒渣进行资源的循环利用，可有效增加其附加值，具有重要的经济价值和社会效应。

高压脉冲电场辅助提取作为一种非热的提取技术[7-8]，对于提取花色苷等稳定性差的天然产物具有重要作用，这可能与细胞壁的破坏，通透性的改变有关。该方法能有效降低活性物质的损失，具有操作简单、耗时短的优点[9]，被广泛应用于活性物质提取，但国内外直接利用紫薯发酵酒副产物，提取花色苷的研究还鲜有报道。

因此，试验以紫薯酒渣为研究对象，通过高压脉冲电场辅助提取紫薯酒发酵副产物中花色苷，并通过响应面设计优化提取工艺，对于紫薯的深加工和资源利用具有重要应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫薯酒渣（实验室自制）；矢车菊素-3-葡萄糖苷标准品（纯度≥98%，南京景竹生物有限公司）；无水乙醇、盐酸（均为分析纯，成都科龙试剂有限公司）。

UV-Vis光度计（北京普析）；精密pH计FE20型（瑞士Mettler-Toledo公司）；电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-Qadvantage超纯水系统（德国Millpore公司）；高压脉冲电场提取装置[10]（实验室自制）。

1.2 试验方法

1.2.1 花色苷相对含量的测定

pH示差法能简便、快速的进行花色苷含量测定[11-12]。其计算方法如下：

式中：M为矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔质量，449.2 mg/mol；DF为稀释倍数；ε为摩尔吸光系数，26 900。

1.2.2 花色苷提取方法

在室温条件下，利用体积分数60%酸性乙醇（pH 3.5），以不同液料比值，通过高压脉冲电场辅助提取紫薯酒渣中的花色苷。考察电场强度、脉冲数及液料比值等3个因素对花色苷提取率的影响。试验选择的电场强度为5，10，15，20和25 kV/cm；脉冲数为4，6，8，10和12；液料比值为5，10，20，30和40（mL/g）。

1.2.3 响应面试验优化

根据单因素试验结果，以液料比值、脉冲数以及电场强度等3个因素为变量，以紫薯酒渣花色苷含量为响应值，使用Design-Expert优化高压脉冲电场提取工艺。响应面设计如表1所示。

表1 响应面试验因素水平表

1.2.4 DPPH自由基清除能力试验

根据Kahkonen[13]的自由基清除能力试验设计方法，测定VC、紫薯花色苷和紫薯酒渣花色苷清除DPPH自由基的能力。分别将2 mL样品溶液（0.625～1 mg/mL）分别与2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液或2 mL蒸馏水混合均匀，避光静置1 h，测定其在最大吸收时的吸光度As和Ab；再将2 mL DPPH乙醇溶液与2 mL蒸馏水混匀，以相同方法测定Ac。DPPH自由基清除能力根据如式（3）计算。

2 结果与讨论

2.1 紫薯酒渣花色苷提取的单因素试验

2.1.1 电场强度对提取效果的影响

电场强度对紫薯酒渣花色苷提取效果的影响如图1所示。随着电场强度加强，紫薯酒渣花色苷含量逐渐增大，电场强度为20 kV/cm时，花色苷的提取效果最好，花色苷含量达到62.1 mg/100 g。这可能是由于较大电场强度导致细胞壁迅速受损，加速花色苷的溶出。然而，当电场强度继续增大时，过大的电场强度可能破坏花色苷分子结构，影响其稳定性，从而导致花色苷的提取效果呈现下降趋势。

2.1.2 液料比值对花色苷提取影响

不同液料比值对紫薯酒渣花色苷提取效果的影响如图1所示。液料比值低于20（mL/g）时，花色苷的提取效果随着提取液量的增加而增加，而液料比值超过20（mL/g）时，花色苷提取率显著降低。由此可见，液料比值为20（mL/g）时，提取效果较好。这可能是由于溶液中花色苷含量饱和，而液料比值超过临界值后，花色苷溶解在溶液中较多，花色苷浓度降低。

2.1.3 脉冲数对花色苷提取影响

脉冲数对紫薯酒渣花色苷提取效果的影响如图1所示。随着脉冲数增加，紫薯酒渣花色苷的提取效果逐渐增加，脉冲数10时，花色苷的含量达到62.4 mg/100 mg，这可能与电子脉冲促进细胞壁加速破坏有关。脉冲数直接影响高压脉冲电场的作用时间，当作用时间在一定的范围内持续增加时，有助于花色苷的提取。

2.2 回归模型的建立与分析

通过单因素试验，以液料比值（A）、脉冲数（B）和电场强度（C）等3个因素为自变量，花色苷含量为响应值，利用Design-Expert软件，根据Box-Behnken模型进行响应面试验优化设计，试验设计及结果如表2所示。

表3为紫薯酒渣花色苷含量的方差分析结果。建立的回归方程为：Y=63.1+1.84A+1.21B+1.85C+1.7AB-0.73AC-0.28BC-6.28A2-0.97B2-2.8C2。

图1 单因素对紫薯酒渣花色苷提取率的影响

表2 Box-Behnken试验设计及结果

表3 方差分析表

该数学模型达到极显著水平（p＜0.001），而失拟项不显著（p=0.092 2＞0.05），说明模型的拟合度高，可用于预测紫薯酒渣花色苷的含量。回归方程的相关系数（R2）为0.981 1，说明各变量与响应值的相关性显著。3个因素对紫薯酒渣花色苷含量的影响极显著（p＜0.01），影响顺序为电场强度＞液料比值＞脉冲数。各因素的二次项及其交互作用对花色苷含量的影响达到显著水平。

2.3 交互作用分析

因素交互作用的三维响应面图如图2所示。响应面表示在一个自变量为零水平时，另外两自变量交互作用对紫薯酒渣花色苷含量的影响情况。如图2所示，液料比值20（mL/g），随着脉冲数和电场强度增加，花色苷加速从紫薯酒渣中溶出，但电场强度超过20 kV后，提取的花色苷含量出现下降趋势，这可能与过大电场强度破坏花色苷稳定性有关[14]。由图2可见，尽管随着电场强度增加，紫薯酒渣花色苷的含量先增加，之后稍微减少，但其交互作用应主要归功于液料比值的增加[15-16]。这可能是由于提取溶剂的增加，增强导电性，从而加速物质的溶出。由图2可见，紫薯酒渣花色苷的提取率受液料比值和脉冲数的交互作用影响较为明显。

根据预测分析，响应面的最优条件为：液料比值21（mL/g）、电场强度18.3 kV/cm、脉冲数9.3。此时预测响应值为64.02 mg/100 g。在该条件下，紫薯酒渣花色苷的提取含量为63.9 mg/100 g，与理论预测值接近，表明响应面优化模型可用于确定最佳工艺条件。

2.4 紫薯酒渣花色苷清除DPPH能力

图3展示紫薯酒渣花色苷和紫薯花色苷的DPPH自由基清除能力，并用VC的测定结果作为对照。紫薯花色苷质量浓度为1 mg/mL时，清除DPPH能力达到90.1%。紫薯酒渣花色苷清除DPPH能力也呈现出相似趋势，随着紫薯酒渣花色苷浓度增加，其抗氧化能力迅速增加，质量浓度达到1 mg/mL时，其对DPPH的清除率可达81.9%。尽管紫薯酒渣花色苷清除DPPH能力弱于紫薯花色苷，但其与VC的DPPH清除能力相近，说明紫薯酒渣花色苷仍具有较好的抗氧化活性。这可能是因为紫薯的发酵过程使花色苷的分子结构发生改变，从而引起抗氧化活性的变化。

图2 各因素交互作用对紫薯酒渣花色苷提取率的响应曲面图

图3 紫薯花色苷、紫薯酒渣花色苷和VC清除DPPH自由基能力（n=3）

3 结论

通过响应面设计对紫薯酒渣花色苷的提取工艺进行优化，其最优提取工艺为：液料比值21（mL/g）、电场强度18.3 kV/cm、脉冲数9.3。此时预测响应值为64.02 mg/100 g。经试验验证，实际含量为63.9 mg/100 g，表明模型能用于预测紫薯酒渣花色苷的提取工艺。DPPH清除能力试验表明紫薯酒渣花色苷具有较强的抗氧化能力。因此，紫薯酒渣可作为花色苷开发利用的潜在资源。