HPLC法测定新疆地区红枣中黄酮类物质的含量

袁辉，张煌涛，王建玲

新疆产品质量监督检验研究院（乌鲁木齐 830011）

红枣是新疆的一种特产，属李科枣属水果，具有补气养血、养血安神的功效；干果肉厚、皮薄、味甜、无污染的特点。目前，新疆红枣种植面积和产量已跃居全国第一，成为新疆农业支柱产业之一[1]，新疆红枣年产量超过3.00×106t，位列各省首位，属优势特色农产品[2]。

现代药理学发现，红枣含有蛋白质、脂肪、糖类、有机酸、微量元素等丰富的营养成分。研究表明，包括癌症、冠心病、高血压、心肌梗塞在内的40余种疾病均与人体内环磷酸腺苷cAMP代谢相关[3]，对心脏起到营养心肌、正性肌力、舒张血管、抗血小板凝聚和抗心律失常的作用。cAMP在枣中的含量是现在所有已测动植物材料中最高的[4]。红枣中的黄酮类物质，如芦丁、槲皮素等，具有止咳、祛痰、平喘、抗菌、抗病毒活性、抗衰老、增强免疫力等作用，绿原酸具有抗炎[5]、抗病毒[6]的功效。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

试验材料，新疆各产地红枣50批次；环磷酸腺苷对照品（东京化成工业株式会社）；芦丁、槲皮素、绿原酸对照品（德国Dr. Ehretorfer GmbH公司）；甲醇（德国默克公司）；磷酸二氢钾等均为分析纯。

2695高效液相色谱仪（美国WATERS公司）；BSA224S型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；SB-800DTD超声清洗仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）；5418离心机（德国Eppendorf）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品前处理

将红枣样品切成细条，放入100 ℃烘箱中烘干，然后粉碎过50目筛，备用。准确称取2 g（精确至0.000 1 g）粉碎样品于离心管中，加入一定量的水，超声提取30 min，冷却至室温后用水定容至50 mL。在4 000 r/min下离心10 min，取上清液，过0.22μm滤膜，供环磷酸腺苷待测使用。

准确称取4 g（精确至0.000 1 g）粉碎样品于离心管中，加入一定量的30%甲醇水溶液，超声提取30 min，冷却至室温后用30%甲醇水溶液定容至50 mL。在4 000 r/min下离心10 min，取上清液，过0.22 μm滤膜，供芦丁、槲皮素和绿原酸待测使用。

1.2.2 标准溶液的配制

准确称取4种对照品，各0.1 g，定容至100 mL，配制成1 mg/mL的标准储备液，于4 ℃冷藏避光保存，使用前将环磷酸腺苷储备液用水稀释成1～20 μg/mL的标准工作液，芦丁、槲皮素、绿原酸三种储备液用30%甲醇水溶液稀释成0.1～5 μg/mL的混合标准工作液。

1.2.3 色谱条件

环磷酸腺苷测定条件：大连依力特公司ODS-BP色谱柱（5 μm，4.6 mm×200 mm），柱温为40 ℃，流动相为20 mmol/L磷酸二氢钾溶液（pH 3）-甲醇（80∶20，V/V），流速为1 mL/min，进样量为10 μL，波长为254 nm。

芦丁、槲皮素、绿原酸测定条件：流动相为20 mmol/L磷酸二氢钾溶液（pH 3）-甲醇，流速1 mL/min，梯度洗脱，见表1，进样量为10 μL，波长为325 nm。

图1 槲皮素、绿原酸、芦丁、环磷酸腺苷的分子结构图

表1 HPLC 梯度洗脱程序

1.3 数据处理

通过液相色谱仪相配套的Empower 3色谱数据处理软件完成相关成数据采集与处理，利用Origin Pro 8.5进行绘图。

2 结果与分析

2.1 线性关系与检出限

测定质量浓度为1，2，4，10和20 μg/mL的环磷酸腺苷标准溶液，以及质量浓度分别为0.1，0.2，0.4，0.8和1 μg/mL的芦丁、槲皮素、绿原酸混合标准溶液，绘制标准曲线，求得线性回归方程和线性相关系数（R）。相关系数均大于0.999，表明在此浓度范围内4种待测组分线性关系良好。以3倍信噪比确定方法检出限（LOD），LOD为0.2～1 mg/kg，结果见表2，对照品和红枣样品的色谱图见图2。

表2 4种物质的线性回归方程、线性范围、相关系数及检出限

图2 红枣的HPLC色谱图

2.2 测定结果

对50批次红枣进行测定，得到新疆红枣中环磷酸腺苷及芦丁、槲皮素、绿原酸的数据结果，结果见表3。

表3 50批次红枣测定数据 mg/kg

2.3 回收率与精密度试验

称取已知环磷酸腺苷和芦丁、槲皮素、绿原酸含量的同一红枣样品，共18份，参照4种待测组分的方法定量限、样品平均含量以及最高含量分别添加标准溶液，制备低、中、高3个浓度水平的加标样品，按照1.2小节制备，并按照规定的色谱条件进行测定，结果见表4。

表4 样品添加浓度及回收率试验

2.4 稳定性试验

取同一样品处理液，室温避光保存24 h，隔2 h测定1次，环磷酸腺苷、芦丁、槲皮素、绿原酸峰面积的RSD分别为0.32%，0.63%，0.85%和0.68%，表明样品处理液在室温避光保存条件下24 h内稳定。冷藏避光保存1周，每天测定1次，环磷酸腺苷、芦丁、槲皮素、绿原酸峰面积的RSD分别为0.58%，0.77%，0.85%和0.56%，表明样品处理液在冷藏避光保存条件下1周内稳定。芦丁、绿原酸见光不稳定，光照下色泽变暗，需避光保存。

2.5 重复性试验

称取同一红枣样品，共6份，按照上述两个条件进行提取并测定，计算得到环磷酸腺苷的方法RSD，为1.87%，芦丁、槲皮素、绿原酸的方法RSD为2.31%～2.92%，表明此次试验中两种提取方法重复性良好。

2.6 前处理条件的选择

环磷酸腺苷的样品提取方法主要有加热回流提取法[7]、超声提取法[8]、快速溶剂萃取法[9]等。经比较，采用超声提取法，具有经济、快捷的优势。

芦丁、槲皮素、绿原酸样品处理过程中[10-11]，比较100%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、10%甲醇和水的处理效果。结果表明，30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇均可达到良好提取效果，当甲醇含量较高时，杂质溶出增加，提取液较混浊，色谱干扰严重。最终确定30%甲醇水溶液为提取溶剂。采用此方案还可使甲醇与水的比例和梯度洗脱初始条件下流动相匹配，可避免样品提取液的洗脱强度高于流动相，产生溶剂效应，造成色谱峰变形，分离度降低。分别考察了10，15，30，45和60 min的超声提取效果，结果表明，超声30 min以后，延长提取时间，提取率无明显增加，故提取时间选择30 min。

2.7 色谱条件

在测定波长的选择上，芦丁最大吸收波长为256 nm，槲皮素最大吸收波长为255 nm，绿原酸最大吸收波长为325 nm，因绿原酸响应值较低，故芦丁、槲皮素、绿原酸同时检测时，确定其测定波长325 nm。此波长下，样液中有吸收响应的杂质较少，因此色谱干扰峰较少，有利于待测物的准确定性定量。由于环磷酸腺苷和多酚类的芦丁、槲皮素、绿原酸均呈弱酸性，其pKa在5～6之间，因此调整磷酸二氢钾溶液pH 3，将流动相pH与待测组分pKa相差两个单位，抑制待测组分电离，使其色谱行为可控，保留时间稳定，保证了色谱分离的重现性。

2.8 新疆红枣中有效成分含量分析

从50批次不同产品和品种的红枣测定结果可以看出，新疆各地红枣中绿原酸的含量为0.44～2.16 mg/kg，平均值为0.88 mg/kg；芦丁的含量为0～14.86 mg/kg，平均值为4.43 mg/kg；槲皮素的含量为0.38～2.15 mg/kg，平均值为0.96 mg/kg；环磷酸腺苷的含量为50.48～357.28 mg/kg，平均值为190.68 mg/kg。

3 结论

此次试验建立了高效液相色谱法测定红枣中环磷酸腺苷及芦丁、槲皮素、绿原酸的方法，通过提取条件的优化，选择了经济、快捷的前处理方法，建立色谱条件。总体上该方法简单、快速、准确度高、精密度好，完全满足红枣中4种成分测定的需求，并对新疆各产地不同品种50批次红枣进行测定。从结果看，这4种有效物质含量差异较大，说明产地、品种不同，新疆红枣的品质有较大差异。新疆日照时间长，光热丰富，降雨少，土质优，以其得天独厚的地理气候环境孕育了世界闻名的新疆大枣，如何全面评价新疆红枣的品质，使新疆的红枣产业健康、持续、稳定的发展，为红枣的开发利用提供科学依据，是目前需要认真研究的问题。