PD-1/PD-L1抑制剂活性筛选模型的建立与研究

易春蝶,李文君,娄嘉豪,吕 典,马燕华,尹俊林,曾广智

(云南民族大学 民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室,云南 昆明 650500)

癌症危害人类生命,已成为人类健康的主要杀手之一.传统的癌症治疗方法主要有手术治疗、放射治疗和化学治疗.临床上,通过手术切除癌变的肿瘤,配合化疗和放疗,对部分恶性肿瘤具有较好的治疗效果,但同时也存在一定的不足.手术治疗主要适用于早期实体肿瘤,对于血液系统和晚期肿瘤无效；放射治疗主要针对相对比较局限的实体肿瘤；化学治疗主要通过细胞毒性化学药物杀灭肿瘤,存在靶向性差、毒副作用大等缺点[1].所以对于靶向性新型抗肿瘤药物的研究一直是药学研究人员关注的重点.

肿瘤免疫疗法是通过激活机体免疫系统产生抗肿瘤作用的一种治疗方式, 近些年来已成为继放疗、化疗、手术之后第4种有效的癌症治疗方法,为肿瘤治疗开拓了新途径[2].免疫检查点(immune checkpoint)是指免疫系统中存在的一些抑制性信号通路.正常情况下,免疫检查点可以通过调节自身免疫反应的强度来维持免疫耐受,然而,机体在受到肿瘤侵袭时,免疫检查点的激活可抑制自身免疫,有利于肿瘤细胞的生长和逃逸[3].以免疫检查点阻断疗法为代表的肿瘤免疫治疗在肿瘤临床治疗中取得了突破性进展,表明操纵免疫负性调控途径可以创建有效的免疫治疗方法,同时也提示肿瘤微环境在抑制或增强免疫应答中发挥重要作用.

PD-1(programmed cell death protein 1,程序性死亡受体1)是免疫检测点蛋白之一,是1种重要的免疫抑制分子,表达于T细胞和初级B细胞表面,在其分化和凋亡过程中发挥作用[4].PD-1有2个配体,PD-L1(programmed cell death Ligand 1,程序性死亡配体 1 )和PD-L2(programmed cell death Ligand 2,程序性死亡配体 2)[5].PD-L1蛋白表达于多种细胞表面[6],通过与T细胞上的PD-1受体相互作用,从而抑制T细胞的活化,引起T细胞凋亡,在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用.在许多人类肿瘤组织中均可检测到PD-L1蛋白的表达,肿瘤部位的微环境也可诱导肿瘤细胞表达PD-L1蛋白[6],当肿瘤细胞上的PD-L1与T细胞上的PD-1结合时,T细胞活化受抑制而不能识别肿瘤细胞,从而导致肿瘤的免疫逃逸.在该免疫抑制环境下,癌细胞能够无限制地增殖,从而导致癌症的发生及发展.通过阻断负性免疫调节因子与癌细胞的相互作用,或阻断其受体对免疫效应细胞的抑制作用来逆转这些效应,原则上有助于消除癌症.

PD-1/PD-L1是目前肿瘤免疫治疗中最具潜力的治疗靶点.以PD-1/PD-L1为代表的免疫检查点抗体抑制剂已经应用到临床,在改善各种晚期癌症的临床治疗中取得了显著的效果,如PD-1抗体抑制剂Pembrolizumab和Nivolumab已被FDA批准用于治疗晚期黑色素瘤、非小细胞性肺癌、霍奇金淋巴瘤和头颈鳞癌等[7-10].除此之外,其他多种PD-1/PD-L1单克隆抗体抑制剂也进入临床研究,如Atezolizumab和Durvalumab等已进入Ⅲ期临床研究,治疗范围覆盖非小细胞肺癌、黑色素瘤、膀胱癌等多个瘤种[11-13].目前上市和进入临床研究的PD-1/PD-L1抑制剂皆为抗体类药物,其小分子药物的研究较为滞后,仅有PD-1/PD-L1小分子抑制剂的少量报道[14-15],这也给PD-1/PD-L1小分子抑制剂药物的研发留下了很大的空间.为了能快速发现PD-1/PD-L1小分子抑制剂,采用酶联免疫吸附(Enzyme Linked Immuno sorbnent Assay, ELISA)方法,建立了PD-1/PD-L1抑制剂体外筛选模型,并对其筛选条件进行了优化,对筛选模型的有效性进行了验证.最后利用该筛选模型,对一些具有抗炎活性的植物提取物进行了活性筛选.

1 材料

1.1 试剂与耗材

BMS202(PD-1/PD-L1 inhibitor)购自Selleck公司；Human PD-L1 Protein和Biotinylated Human PD-1 Protein购自北京义翘神州科技有限公司；HRP-conjugated Avidin和TMB显色液购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司；NaCl购自天津市致远化学试剂有限公司； Hepes购自Biological Industries公司；α-Dithiothreitol购自Sigma公司；Tris购自上海生工生物公司；牛血清白蛋白(BSA)购自Biosharp生物科技有限公司；其他常用试剂皆为国产分析纯试剂.高吸附ELISA 96孔板购自Corning公司.

1.2 仪器

SpectraMax i3x型微孔板检测器(Molecular devices,美国)；QB-9006型恒温加热摇床(其林贝尔,中国).

2 方法与结果2.1 实验原理

将PD-1蛋白包被于96孔板,加入待测化合物和Biotinylated PD-L1蛋白,PD-1特异性地结合PD-L1,去除未结合的PD-L1蛋白后,加入HRP-conjugated Avidin,利用Biotin与 Avidin的高度特异性结合作用,将HRP间接标记于PD-1蛋白,最后利用HRP特异性底物 TMB显色(图1).在此过程中若待测物能抑制PD-1/PD-L1的结合,则最终生成的有色产物量减少,吸光度值降低.

2.2 实验方法

PD-1蛋白用Coating Buffer(20 mmol/L Hepes, pH 7.4；50 mmol/L NaCl；1 mmol/Lα-Dithiothreitol)稀释后,加入96孔板内,每孔100 μL,4 ℃ 包被15～18 h后,弃上清,每孔加入100 μL Blocking Buffer(含2% BSA 的 Coating Buffer),室温封闭1 h.弃封闭液之后加入 Biotinylated PD-L1,室温反应2 h.弃上清,每孔加入200 μL Washing Buffer(200 mmol/L Tris, pH 7.4；1.5 mmol/L NaCl；0.1% BSA；0.05% Tween 20)去除未结合的蛋白与杂质.每孔加入 100 μL用Coating Buffer稀释的过量HRP-conjugated Avidin,室温摇床反应1 h,随后每孔加入200 μL Washing Buffer 彻底洗涤未结合的Avidin. 最后,每孔加入100 μL TMB显色液,室温摇床反应30 min后,每孔加入50 μL 1N H2SO4溶液终止反应,于450 nm处检测其吸光度.

2.3 实验条件优化

分别对PD-1和PD-L1的质量浓度进行优化.取PD-1储备液,用Coating Buffer分别稀释为 0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 μg/mL的工作液,并将其加入96孔板中进行包被,每个质量浓度组均设至少3个平行复孔.之后每孔加入0.40 μg/mL PD-L1溶液孵育并按照2.2的实验方法最终检测吸光度.结果如图2红色曲线所示,随着PD-1质量浓度的升高,PD-1与其配体PD-L1的结合逐渐增多,表现为光吸收值也逐渐增大.从实验经济性及检测灵敏度考虑,选取光吸收值为1～2之间的PD-1质量浓度为试验中底物的包被浓度,即PD-1质量浓度确认为0.50 μg/mL.

确定PD-1质量浓度之后,用0.50 μg/mL的PD-1溶液包被96孔板,再用Binding Buffer(0.05% Tween 20的Coating Buffer)分别稀释至 0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 μg/mL的PD-L1溶液加入已包被PD-1的96孔板中,每个质量浓度组至少设3个平行复孔,按照2.2的实验方法检测光吸收值.如图2所示,随着PD-L1质量浓度的升高,光吸收值也逐渐升高,且数值增加幅度在PD-L1质量浓度达到0.4 μg/mL后呈现减弱趋势.从实验经济性及检测灵敏度考虑,最终确定PD-L1的反应质量浓度为0.30 μg/mL.

2.4 模型验证

实验条件确定后,采用目前已知的抑制剂来验证模型的可靠性.实验结果来自至少6次独立实验.BMS202是2015年Bristol-Myers Squibb(BMS)公司首次公开报道的合成类PD-1/PD-L1小分子抑制剂[15].将 BMS202溶解于DMSO中,之后用Coating Buffe将其分别稀释至0、25、50、100、400、1 000 nmol/L,加入已包被PD-1蛋白的96孔板中,之后按2.2所述步骤开展实验,最后于450 nm下检测OD值.结果如图3所示,BMS202能够剂量依赖性地抑制PD-1和PD-L1的相互作用,其IC50为123.42±1.52 nmol/L,实验结果与已知报道相符,说明了PD-1/PD-L1抑制剂筛选模型的有效性,后续可用于靶向PD-1/PD-L1抑制剂的筛选研究.

2.5 活性筛选

利用已建立的PD-1/PD-L1筛选模型对32个植物来源的天然产物样品进行了活性筛选,包括24个单体化合物和8个植物提取物样品.提取物样品分别来自菊科植物苍耳和落葵科植物落葵薯,在200 μg/mL 质量浓度下其部分样品对PD-1/PD-L1显示一定抑制作用(表1).苍耳子为植物苍耳的干燥成熟果实,为临床常用中药,具有宣肺通鼻、祛湿散寒的功效,临床用于鼻炎、关节炎等的治疗[16].落葵薯是落葵科落葵薯属缠绕藤本植物,其珠芽、叶及根可供药用,具有滋补、消肿散瘀等功效[17].样品溶解于DMSO中,用Binding Buffer稀释到相应浓度后加入已包被PD-1蛋白的96孔板中室温孵育10 min,之后按照2.2的实验方法操作并检测吸光度并计算百分抑制率(I%).结果显示,在100 μmol/L摩尔浓度下,所有化合物对PD-1/PD-L1没有明显的抑制作用(I% < 50%).在200 μg/mL质量浓度下,植物提取物对PD-1/PD-L1的抑制率及植物来源见表1.

表1 植物提取物在200 μg/mL质量浓度下对PD-1/PD-L1的抑制作用及其来源

3 讨论

免疫治疗近年来取得的成绩给治愈肿瘤带来了新的希望.随着人们对肿瘤的认识越来越深刻,肿瘤治愈的种种困难也昭然若揭,深入探讨肿瘤微环境是解决肿瘤问题的关键. PD-1/PD-L1作为肿瘤微环境中重要的免疫检查点,其靶向性抗体药物的陆续上市,给许多“无药可治”的晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌等患者带来了希望[4],因此,开发PD-1/PD-L1 药物逐渐成为热点.体外分子靶向筛选模型是目前药物筛领选领域的重要研究内容,相对于传统整体和器官水平的筛选模式,分子水平的筛选模型具有反应体积小、灵敏快速、特异性强、高效简便等优点,适宜开展高通量药物筛选.采用ELISA方法建立分子水平的PD-1/PD-L1抑制剂筛选模型,在微孔板上进行反应检测,样品消耗量少,特别适用于微量天然产物的活性筛选.

4 结语

通过PD-1/PD-L1抑制剂筛选模型,对32个植物来源的天然产物样品进行了活性筛选,包括24个化合物和8个提取物.在筛选浓度下,化合物都没有显示明显抑制作用.其功效表明2种植物都具有免疫调节的作用,在进行植物化学研究的同时,结合PD-1/PD-L1筛选模型进行活性筛选,可以对其进行活性成分的追踪分离,提高发现活性化合物的效率.