燕麦β葡聚糖对糖尿病大鼠肾功能及其肠道菌群的影响

张维 任锦丽 杨娇 廖章伊 张雅琴

摘要：目的：探讨燕麦β葡聚糖（oat βglucan，OG）对糖尿病大鼠肾功能及肠道菌群的影响。方法：采用单侧肾切除+链脲佐菌素（65mg/kg·BW）一次性腹腔注射方式构建糖尿病肾病（diabetes nephropathy，DN）大鼠模型，将造模成功32只SD雄性大鼠随机分为4组：模型对照组（蒸馏水灌胃）和低、中、高燕麦β葡聚糖干预组（分别用0275、055、11g/kg·BW燕麦β葡聚糖灌胃），每组8只。另取16只大鼠行假手术并随机分组：正常对照组（蒸馏水灌胃）和燕麦β葡聚糖对照组（055g/kg·BW 燕麦β葡聚糖灌胃）。饲养8周，在第8周末采集血液、尿液和粪便，进行血糖、肾功能检测，用HE染色进行肾脏形态学观察，16S rDNA检测分析肠道菌群多样性。结果：高剂量燕麦β葡聚糖能显著降低DN大鼠血糖（P<005），低、中剂量燕麦β葡聚糖能显著降低DN大鼠血尿素氮、肌酐;中、高剂量燕麦β葡聚糖能降低DN大鼠的尿酸/肌酐比值（P<005）;高剂量燕麦β葡聚糖对DN大鼠的肾小球系膜基质增生和基底膜增厚，肾小管上皮细胞肿胀变形、脱落，系膜细胞增生有显著改善作用;高剂量燕麦β葡聚糖能显著升高DN大鼠肠道菌群丰度和多样性、厚壁菌门/拟杆菌门的比值（P<005）。结论：燕麦β葡聚糖能改善糖尿病大鼠肾功能，增加肠道菌群丰度和多样性及升高厚壁菌门/拟杆菌门的比值，这可能是其延缓DN的机制之一。

关键词：燕麦β葡聚糖;糖尿病肾病;肠道菌群

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病最主要的并发症之一，是导致糖尿病患者死亡的主要病因之一[1]。研究证实，燕麦的主要功能成分是β葡聚糖，燕麦β葡聚糖（oat βglucan，OG）是一种水溶性膳食纤维，主要存在于燕麦胚乳和糊粉层细胞壁中，由β（1，3）和β（1，4）糖苷键连接形成一种不可消化的βD葡聚糖，而这一特殊结构使得燕麦β葡聚糖具有降低血糖、调节肠道菌群的作用[25]。近年来，DN与肠道菌群的相关性引起了科学界的关注，肠道菌群的变化与DN的发生发展密切相关[68]。因此，我们推测改善肠道菌群是从源头上减少DN的发生的一个重要环节，本研究建立DN大鼠模型，观察燕麦β葡聚糖对糖尿病大鼠肾功能及其肠道菌群的影响。

1材料与方法

11实验动物及受试物

56只雄性SD大鼠，体重（200±20）g，由北京大学医学部实验动物中心提供。饲养于SPF级动物室，温度20～26℃，相对湿度40%～70%，動物自由进食与饮水，基础饲料为（American Institute of Nutrition1993 Maintenance），AIN93M配方。适应性喂养1周后开始实验，本项目经北京大学生物医学动物伦理委员会审查通过。燕麦β葡聚糖（陕西森弗天然制品有限公司）纯度70%，HPLC级。

12糖尿病肾病大鼠模型建立与分组

选择40只大鼠行左侧肾切除术，术后一次性腹腔注射65mg/kg链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（001mol/L pH 45柠檬酸钠柠檬酸缓冲液配制）。尾静脉采血检测血糖水平，7d后空腹血糖>111mmol/L确定DN模型成功。造模成功的32只DN大鼠，随机分为4组：模型对照组（蒸馏水灌胃）和低、中、高燕麦β葡聚糖干预组（分别用0275、055、11g/kg·BW燕麦β葡聚糖灌胃），每组8只。另取16只大鼠行假手术并随机分组：正常对照组（蒸馏水灌胃）和燕麦β葡聚糖对照组（055g/kg·BW 燕麦β葡聚糖灌胃）。饲养8周，实验结束后采集血清、尿液及新鲜粪便，股动脉采血（禁食12h）后处死大鼠，迅速取出右侧肾脏转入冻存管，-80℃下保存待测。

13检测指标

（1）体重、进食量监测：每周进行体重、进食量监测。（2）血糖及肾功能指标检测：采用全自动生化分析仪检测大鼠血糖、血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、尿酸（uric acid，UA）、肌酐（creatinine，CR）的含量。（3）肾脏形态学检测：以10%多聚甲醛固定肾脏组织，将组织脱水、透明、浸蜡，包埋后切片，切片厚度为4μm，进行苏木精伊红（hematoxylineosin，HE）染色，用显微镜观察组织形态。（4）16S rDNA肠道菌群测序：利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳进行总DNA质检，具体步骤按照说明书操作，所提取的DNA于-80℃保存。前引物序列：CCTACGGGRSGCAGCAG;后引物序列：GGACTACVVGGGTATCTAATC。将得到的PCR产物构建测序文库，采用Illumina Miseq 平台测序，对高质量测序数据进行生物信息学分析，该部分由上海锐翌生物科技有限公司完成。

14统计分析

采用SPSS 200统计学软件进行数据分析，连续变量均以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P<005为差异有统计学意义。

2结果与分析

21大鼠进食量变化情况

实验第0周，正常对照组进食量[（1134±2258）g]与燕麦β葡聚糖对照组进食量[（11517±1942）g]无显著差异，模型对照组[（18058±2217）g]与低[（17565±2044）g]、中[（17914±2474）g]、高[（1709±1168）g]燕麦β葡聚糖干预组进食量无显著差异。随着实验进展，各组大鼠的进食量都增加。但正常对照组，燕麦β葡聚糖对照组，低、中燕麦β葡聚糖干预组进食量增加不明显（P>005），模型对照组、高剂量燕麦β葡聚糖干预组进食量显著增加（P<005），且3个燕麦β葡聚糖干预组进食量均低于模型对照组（P<005）（图1）。

22大鼠体重变化情况

实验第0周，正常对照组体重[（33035±2676）g]与燕麦β葡聚糖对照组体重[（34261±1985）g]无显著差异。模型对照组[（22530±2432）g]与低[（20760±2629）g]、中[（24121±1916）g]、高[（23120±2665）g]燕麦β葡聚糖干预组体重无统计学差异。干预第8周，正常对照组与燕麦β葡聚糖对照组体重均上升，但两组体重上升趋势相似，差异无统计学意义（P>005）;模型对照组、3个燕麦β葡聚干预组的体重均下降，各组体重下降趋势相似，差异无统计学意义（P>005）（图2）。

23燕麦β葡聚糖对大鼠血糖的影响

干预第8周，与正常对照组相比，模型对照组血糖升高，差异有统计学意义（P<005）;与模型对照组相比，3个燕麦β葡聚糖干预组血糖均下降，且高剂量燕麦β葡聚糖干预组血糖显著下降（P<005）（表1）。

24燕麦β葡聚糖对大鼠肾功能的影响

干预第8周，与正常对照组相比，模型对照组的BUN、CR、UA、尿酸/肌酐均显著升高（P<005）;与模型对照组相比，低、中剂量燕麦β葡聚糖干预组BUN、CR显著下降（P<005）;中、高剂量燕麦β葡聚糖干预组尿酸/肌酐比值显著下降（P<001）;燕麦β葡聚糖干预组对UA无影响（P>005）（表2）。

25燕麦β葡聚糖对大鼠肾脏结构的影响

干预第8周，与正常对照组相比，模型对照组肾小球系膜基质增生和基底膜增厚，肾小管上皮细胞肿胀变形、脱落，细胞增生，可见轻度玻璃样改变（图3C）;与模型对照组相比，燕麦β葡聚糖干预组肾小球系膜基质增生和基底膜增厚，肾小管上皮细胞肿胀变形、脱落，系膜细胞增生均有改善，高剂量燕麦β葡聚糖干预组改善最明显，与正常对照组的肾小球系膜基质、肾小管上皮细胞结构相近（图3F），但低剂量燕麦β葡聚糖干预组仍有轻度玻璃样改变（图3D）。

26肠道菌群多样性分析

干预第8周，与正常对照组相比，模型对照组肠道菌群丰度和多样性指数Chao1和Shannon显著降低（P<005）;与模型对照组相比，3个燕麦β葡聚糖干预组肠道菌群丰度指数Chao1均升高，且高剂量燕麦β葡聚糖干预组Chao1指数显著升高（P<005）;低、中、高剂量燕麦β葡聚糖干预组多样性指数Shannon均升高，且低、中剂量燕麦β葡聚糖干预组显著升高（P<005）（表3）。

27菌落的群落结构

干预第8周，在门水平上（图4A），与正常对照组相比，模型对照组的厚壁菌门丰度显著下降、拟杆菌门丰度显著升高、厚壁菌门/拟杆菌门比值显著下降（P<005）;燕麦β葡聚糖干预组与模型对照组相比，拟杆菌门丰度均降低、厚壁菌门的丰度和厚壁菌门/拟杆菌门比值均升高，低剂量燕麦β葡聚糖干预组拟杆菌门丰度显著下降（P<005）、厚壁菌门丰度显著升高及厚壁菌门/拟杆菌门比值显著升高（P<005）。在属水平上（图4B），与正常对照组相比，模型对照组Prevotella（普氏菌属）、Ruminococcus（瘤胃球菌属）丰度显著升高（P<005），

3讨论

本研究通过单侧肾切除+链脲佐菌素（65mg/kg·BW）一次性腹腔注射方式构建DN大鼠模型，因其方法简便易行，对胰岛β细胞损伤特异性高，且死亡率较低而成为当前最常见的DN大鼠的造模方式。当前研究结果显示，单侧肾切除+链脲佐菌素（65mg/kg·BW）一次性腹腔注射之后大鼠BUN、CR、UA、尿酸/肌酐比值均升高;HE染色可見大鼠肾小球系膜基质增生和基底膜增厚，肾小管上皮细胞肿胀变形、脱落，系膜细胞增生;肠道菌群丰度和多样性均降低，拟杆菌门丰度升高、厚壁菌门丰度及厚壁菌门/拟杆菌门比值均下降，而正常对照组以上指标均无明显变化。以上说明，在当前研究中单侧肾切除+链脲佐菌素（65mg/kg·BW）一次性腹腔注射方式成功构建了DN大鼠模型。本研究还发现，经燕麦β葡聚糖干预后的DN大鼠血清中的尿素氮、CR、尿酸/肌酐与未处理的DN大鼠相比有显著差异;DN大鼠的肾小球、肾小管出现明显的病理学变化;肠道菌群丰度和多样性升高，拟杆菌门丰度下降、厚壁菌门丰度以及厚壁菌门/拟杆菌门比值升高。以上说明，燕麦β葡聚糖对DN大鼠有积极的治疗作用。

本研究结果显示，燕麦β葡聚糖干预组血糖、BUN、CR含量及尿酸/肌酐比值均低于模型对照组中的含量且改善了DN引起的肾小球系膜基质增生和基底膜增厚，肾小管上皮细胞肿胀变形、脱落，系膜细胞增生的情况。这说明燕麦β葡聚糖对DN具有保护作用。这与我们之前的研究结果一致，即燕麦β葡聚糖可能是DN的一种潜在的治疗物质。此外，在我们的结果中，燕麦β葡聚糖干预组肠道菌群Alpha多样性升高（Alpha 多样性反映的是单个样品内部的物种多样性，利用肠道菌群丰度和多样性指数Chao1、Shannon来衡量，此数值越大说明样品物种的丰度和多样性越高[910]）。在门水平上，燕麦β葡聚糖干预组厚壁菌门丰度相对上升，拟杆菌门丰度相对下降，且厚壁菌门/拟杆菌门比值升高。这提示燕麦β葡聚糖对DN大鼠的治疗作用可能与改变其肠道菌群Alpha多样性，厚壁菌门、拟杆菌门的丰度以及二者之间的比值有关。已有研究显示[11]，肠道菌群与2型糖尿病等代谢性疾病的发病密切相关，其潜在机制与肠道菌群丰度和多样性的变化有关。Larsen等[11]研究表明，厚壁菌门/拟杆菌门的比值和2型糖尿病的发生呈负相关，且2型糖尿病患者厚壁菌门相对丰度降低，而拟杆菌门等丰度相对升高[1213]，原因可能是厚壁菌门中多数细菌产生丁酸盐菌[14]。丁酸盐是一种短链脂肪酸盐，它能促进肠内分泌L细胞分泌胰高血糖素样肽1（GLP1）和肽YY（PYY），GLP1可改善胰岛功能并调节胰岛素的释放，从而起到降低血糖的作用[15]。本研究通过构建大鼠DN模型进一步说明了肠道菌群在2型DN发生发展中所发挥的重要作用，并提供了燕麦β葡聚糖对DN大鼠具有保护作用的证据。

综上所述，燕麦β葡聚糖能改善DN大鼠血糖及肾功能，其机制可能是调节肠道菌群丰富、多样性以及厚壁菌门/拟杆菌门的比值。◇

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