bFGF转染骨髓间充质干细胞移植对新生骨成熟过程的生物力学影响—兔胫骨延长模型研究

刘增运，任志勇，汤丽国，杨跃，王辉，霍继贞

（1.山东阳光融和医院 骨科，山东 潍坊 262100；2.中国人民解放军陆军第80集团军医院 创伤骨二科，山东 潍坊 261021）

1 材料与方法

1.1 材料

纯种新西兰大白兔共48只，均为雄性，体重3.0～3.5 kg，由陆军第80集团军医院实验室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞模型的制备

将新西兰兔麻醉，取胫骨分离间充质干细胞进行分离培养传代6代以上获得纯度较高的间充质干细胞；后将bFGF基因转染修饰获得的间充质干细胞使其基因高表达。

1.2.2 动物模型的分组及建立

首先将实验动物行常规术前准备，在左小腿前内侧分离肌肉，充分显露整条胫骨，纵行切开骨膜并进行剥离，在胫腓骨结合平面以下以细线锯横行截断胫骨，生理盐水充分冲洗伤口，并进行骨干复位，安装人掌骨延长外固定架，依次缝合骨膜、皮下组织、皮肤。按体重相同或相近将48只实验动物分为16个区组，再将每个区组中的3个受试对象随机分配到3个处理组。实验组于延长结束后向牵张间隙内注入200 μL bFGF转染的骨髓间充质干细胞，将相同浓度骨髓间充质干细胞注入作为对照组，空白组不注入任何物质。

术后第6、12周时每组分别取8只实验动物，周围正常骨组织标本作为对照。

1.3 检测指标

1.3.1 影像学检查

术后第12周拍摄胫骨正位片（管球电压15 kv，曝光时间1 s）。应用lmage J图像分析软件测量新生骨的灰度值和面积，及正常骨的灰度值，所得比值为相对灰度(%)。

1.3.2 HE染色

宜兴市秸杆还田方式主要为套播麦秸秆覆盖还田和稻秸秆切碎匀铺后进行播种，然后采用旋耕开沟一体机作业两种方式。在播种季节宽余、土壤墒情适宜、天气条件允许的情况下，可采用水稻收获秸秆切碎匀铺后，进行施肥、播种，有利于控制播量，均匀播种。然后利用旋耕—开沟一体机进行浅旋耕灭茬、开沟，可起到种、肥、草、泥混合，并消灭露籽的效果。

术后第6周观察各组牵张成骨区炎性细胞及破骨细胞情况；术后第12周检测各组牵张成骨区骨形成、钙盐沉积及骨细胞生长情况。

1.3.3 骨密度(BMD)测定

术后12周每组取8只兔麻醉后留取骨标本，测定骨密度，我们选取骨折处的骨密度与该骨正常处的骨密度比值作为测量指标。

1.3.4 生物力学测试

取兔两侧的胫骨做生物力学测试，骨密度测定完成后，用CSS-4000万能材料测试仪进行生物力学测试。取兔胫骨手术侧/非手术侧比值作为统计数据，以此排除了个体差异。

2 结果

2.1 影像学结果分析

各组在固定期第12周拍正位X线片，应用Image J分析新生骨的面积和灰度值，同时测量该段骨上某一固定位置的正常骨灰度值，它们的比值为相对灰度(%)，行方差分析，然后行两两组间配对t检验，P＜0.05，差异有统计学意义，各组间面积比较差异无统计学意义（表1）。

表1 12周X线片骨灰度值结果分析（±s）

表1 12周X线片骨灰度值结果分析（±s）

相对灰度值（%）实验组 9 3.3 0 8±5.0 0 3对照组 7 8.4 3 2±6.5 3 1空白组 7 4.8 6 2±6.0 0 3

2.2 HE染色观察新生骨情况

各组兔于固定期第6周留取标本：对照组及空白组可见大量炎性细胞浸润，破骨细胞减少，基本无骨痂形成；实验组可见炎性细胞浸润明显减少，破骨细胞减少，纤维软骨骨痂形成（图1）。

图1 各组固定期第6周牵张间隙新生骨组织（HE染色×100）

术后第12周：与空白组及对照组相比，实验组骨性骨痂明显增多，可见均匀钙盐沉积，肥大骨细胞形成（图 2）。

图2 各组固定期第12周牵张间隙新生骨组织（HE染色×100）

2.3 骨密度值测定

数据采用SPSS 18.0统计程序行统计学分析，实验组与对照组、空白组比较差异有统计学意义（P＜0.05），对照组与空白组比较差异无统计学意义(P＞0.05，表 2）。

表2 12周BMD结果分析（±s）

表2 12周BMD结果分析（±s）

BMD相对值（%）实验组 48.2±21.3对照组 29.8±20.5空白组 27.5±20.2

2.4 生物力学测定结果分析

生物力学测定各项指标采用SPSS 18.0统计软件行统计学分析。实验组与其他两组在扭转强度、扭力、破裂能三个测试指标差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组与空白组比较差异无明显统计学意义(P＞0.05)；各组处理因素对扭转角测试无明显影响，差异无统计学意义(P＞0.05，表3)。

表3 12周生物力学结果分析（±s）

表3 12周生物力学结果分析（±s）

扭转强度（MPa） 扭力(N) 扭转角(°) 破裂能实验组 89.1±4.5 75.2±1.9 83.4±3.4 63.4± 2.1对照组 78.8±7.1 63.4±3.7 82.1±3.1 52.1± 3.5空白组 64.7±5.6 53.7±8.1 80.7±7.3 43.9±10.3

3 讨论

Ilizarov技术用于解决骨髓炎、骨折后不愈合以及先天性胫骨假关节等十三个方面创伤及矫形方向的问题[3]。该技术自20世纪80年代后陆续传入世界各国，随着世界各国医疗专家对Ilizarov外固定架的不断改造及升级，这门技术再次在创伤、矫形等相关学科焕发出青春[4]。

bFGF大小约17 KD，由155个氨基酸残基组成，存在于多种动物体内，主要分布于动物的垂体组织内。研究已证实bFGF主要的作用包括：显著促进神经干细胞的增殖与分化，并且对血脑屏障起保护作用；与肝素联合应用显著促进烫伤创面的修复能力，缩短治疗时间；作为体外枝接支架应用于组织修复再生；促进间充质干细胞向成骨细胞转化等重要的作用[5-7]。本实验通过对相对灰度、HE染色、骨密度测定、生物力学测试四个检测指标进行测试，最终结果均证实实验组牵张区的成骨质量明显优于对照组及空白组。总之，该实验进一步证实了经bFGF基因转染的骨髓间充质干细胞可通过分泌bFGF对延长区成骨质量起到了明显的促进作用[8-10]。但与其他生长诱导物质的联合作用机制及作用效果，还需要作进一步研究。