同型半胱氨酸经内质网应激介导小鼠心肌损伤

杜海林，张文勇，杨绍兵，贾绍斌

血清同型半胱氨酸（Hcy）是人体经食物摄入的一种含硫氨基酸，异常升高的Hcy可通过多种不同机制诱导疾病的发生[1]。在Hcy诱导疾病发生的机制中，内质网应激（ERS）是近年来备受关注的研究热点[2]。生理条件下，ERS相关蛋白胰腺内质网激酶（PERK）处于失活状态。病理状态下，PERK与未正确折叠的蛋白结合，触发未折叠蛋白反应（UPR），从而发挥细胞保护作用[3]。如损伤因素诱发的ERS持续存在，PERK磷酸化为磷酸化PERK（p-PERK）,激活CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）以及其下游靶点内质网氧化还原酶α（ERO1α），而活化后的CHOP和ERO1α被认为是细胞凋亡的启动因子[4]。本课题组前期研究发现[5]，除动脉粥样硬化导致缺血外，Hcy亦是导致慢性心力衰竭的又一独立危险因素[6]。目前Hcy通过ERS导致动脉斑块形成的研究较多，而Hcy对心肌直接影响尚鲜见报道。为研究Hcy是否直接介导了心肌损伤，本课题组设计了此项实验，旨在探讨血清Hcy对心肌的损伤作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验时间为2016年11月10日至2018年1月16日。实验小鼠（SPF级）由北京大学实验动物中心提供，并通过宁夏医科大学实验动物伦理委员会批准；动物生长维持饲料及高蛋氨酸（HM）饲料购自北京科奥协力饲料有限公司；ERS阻断剂4-苯基丁酸(4-PBA)，购自Sigma公司；SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自康为世纪；鼠抗β-actin单抗购自中杉金桥；ER-Stress抗体试剂盒购自CST公司；Hcy测定试剂盒购自山东博迈达生物科技有限公司；全蛋白提取试剂盒及BCA蛋白含量检测试剂盒均购自凯基生物。

1.2 动物模型的建立

健康5周龄ApoE基因敲除实验小鼠27只，均于实验动物中心SPF环境下饲养，随机分为对照组、HM组及4-PBA组，每组各9只。对照组给予小鼠生长维持饲料喂养，HM组及4-PBA组给予HM饲料喂养。Hcy是蛋氨酸代谢的中间产物，给予高蛋氨酸饮料喂养用于构建小鼠高Hcy血症模型。所有实验小鼠喂养16周后，4-PBA组给予腹腔内注射ERS阻断剂4-PBA[7]，剂量为5 mg/kg,每周两次，共12周，其余两组小鼠均按原饲养方法继续喂养12周。所有小鼠共完成28周干预后处死，快速眼球取血用于后续实验，心脏经多聚甲醛灌注后剥离，留取标本分别固定及冻存，其中固定标本浸泡于4%多聚甲醛，冻存标本经液氮速冻后保存于-80℃冰箱。

1.3 血清Hcy测定

所有小鼠全血经4 000 g离心10 min后取上层血清，使用Hcy测定试剂盒检测血清Hcy浓度，首先用试剂盒内标准样品制作标准曲线，曲线R2=0.997，再将每个样本检测三次，取三次结果的平均值作为该小鼠血清Hcy浓度，分组记录。

1.4 电镜观察心肌细胞器

剥离小鼠心脏后采集心肌组织，在4℃环境下行前固定、后固定、脱水、分组包埋，分别取心肌细胞横轴及纵轴切片，电镜下3 000倍观察细胞器。

1.5 心肌组织苏木素-伊红（HE）染色及免疫组化

所有固定心肌组织经脱水后行石蜡包埋及切片，常规脱蜡、脱水，HE染色观察各组小鼠心肌大体结构及细胞结构。免疫组化切片继续行高压修复，山羊血清封闭，加ERO1α单克隆抗体于4℃冰箱过夜，次日按辣根过氧化物本酶（DAB）显色试剂盒操作，并行HE染色，封片，正置显微镜下观察染色效果，采集图像。

1.6 心肌组织蛋白免疫印迹（Western blot）

称取冻存心肌组织50 mg，使用全蛋白提取试剂盒，按试剂盒操作说明完成蛋白提取，BCA蛋白含量检测试剂盒检测蛋白含量，取60 µg蛋白样品，以10%SDS-PAGE凝胶电泳后转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，室温下脱脂牛奶封闭 90 min，加入一 抗PERK(兔 源1 :1 000)、CHOP(鼠源1 :1 000)、ERO1α(兔源1 :1 000)、β-actin(鼠源1 :2 000)于4℃孵育过夜，次日洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育 1 h，ClinxChemiScope6300自动曝光，并使用设备配套软件分析条带灰度值，以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参。

1.7 统计学方法

本研究所有数据均采用SPSS 21.0 数据统计包分析。连续变量采用±s表示，两组间比较采用t检验；多组之间比较使用方差分析；所有统计均采用双侧检验，当P≤0.05时认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 血清Hcy测定评估模型建立

与对照组比较，HM组及4-PBA组血清Hcy水平增高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）；与HM组比较，4-PBA组血清Hcy水平差异无统计学意义（P＞0.05），如图1所示。

图1 三组小鼠血清Hcy水平比较(n=9)

2.2 心肌组织结构及细胞器的形态学观察

通过光镜观察HE染色的心肌切片，分别在100倍及200倍镜下观察。三组心肌细胞HE染色良好，心壁无明显增厚及变薄，心肌细胞形态正常，胞质均匀，无病理性核分裂相，光镜下各组心肌组织未见明显差异（图2A）。电镜下观察所见，胞核细胞器形态正常，HM组内质网肿胀，结构紊乱，在多个切面可见内质网腔扩张，4-PBA组内质网肿胀及扩张明显减轻，偶有视野可见上述改变（图2B）。

2.3 ERO1α的免疫组化结果

光镜下观察免疫组化效果，由于ERO1α表达于胞浆，先于低倍镜下观察大体表达差异，再计数高倍镜下每视野胞浆着色细胞与该视野细胞总数之比，作为ERO1α表达的定量指标。每组计数五个视野，分别计算每个视野阳性细胞百分数，将五个视野的平均百分数作统计学分析,如图3所示，与对照组比较，HM组及4-PBA组胞浆中ERO1α表达增加,差异均有显著性统计学意义（P均＜0.01）；与HM组比较，4-PBA组胞浆ERO1α表达减少，差异有显著性统计学意义（P＜0.01）。

图2 苏木素-伊红染色光镜观察心肌组织结构及电镜下观察内质网结构

图3 免疫组化法显示ERO1α在不同组间表达

2.4 Western blot检测PERK、CHOP、ERO1α在心肌组织中表达（图4）

PERK、CHOP、ERO1α等内质网应激相关蛋白在对照组心肌细胞有少量表达，与对照组比较，HM组PERK、CHOP、ERO1α表达均明显增高，差异均有统计学意义（P均＜0.01)；与对照组比较，4-PBA组PERK、ERO1α表达增高，差异有统计学意义（P均＜0.01)，CHOP表达差异无统计学意义（P＞0.05）。与HM组比较，4-PBA组PERK、CHOP、ERO1α表达减少，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

图4 蛋白免疫印迹法显示PERK、CHOP、ERO1α在各组中表达

3 讨论

人体经食物摄入的蛋氨酸经过代谢产生具有毒性作用的中间产物--Hcy，目前各领域相关研究证实其毒性作用表现为致全身多系统疾病，包括2型糖尿病、恶性肿瘤、肾脏疾病及动脉粥样硬化等[8-9]，本课题组研究第一次从病理角度观察到Hcy对心肌的直接损伤，在心肌大体组织结构并无明显改变时，Hcy已通过超微结构变化，影响心肌细胞功能。

心血管疾病与肿瘤是近年WHO公布的主要疾病谱，心血管疾病危险因素包括吸烟、高血压、高脂血症、糖尿病等，近年将缺乏运动及血清高Hcy（≥10 µml/L）列为心血管疾病的危险因素[10]。关于Hcy与心血管疾病相关性，目前较为明确的有：（1）Hcy通过影响烷类物质及嘌呤的代谢，导致超氧化阴粒子堆积，诱发氧化应激[11]；（2）高血清Hcy导致氧化低密度脂蛋（ox-LDL）异常表达[12]，诱导血管中层平滑肌细胞增殖加速动脉粥样硬化（AS）[13]；（3）诱导生长抑制因子和DNA损伤诱导因子（GADD34）以及T细胞死亡基因51（TDAG51）表达，诱发ERS[14]。本课题组实验结果显示，给予小鼠28周高蛋氨酸饲料喂养，血清Hcy水平增高，由于4-PBA作用于Hcy所致ERS的下游[15]，并未导致HM组与PBA组小鼠Hcy水平的差异，成功构建高Hcy模型。与对照组比较，HM组心肌细胞ERS相关因子PERK、CHOP、ERO1α表达均有增高，尽管光镜下组织大体形态结构没有明显变化，但细胞超微结构已存在改变，给予4-PBA阻断ERS后以上因子表达下降、内质网肿胀亦有所改善,提示血清Hcy水平增高触发ERS，而阻断ERS通路后，CHOP、ERO1α等因子表达下降，细胞超微结构的变化亦有所改善。细胞中表达增高的CHOP及ERO1α的被认为是病理性ERS的触发因子[14]，由此证实长时间血清高Hcy水平损伤心肌细胞，其机制可能为高Hcy激活ERS所致，当过度的损伤超过了UPR的代偿能力，细胞内环境的稳定将无法维持，此时ERS会激活线粒体凋亡通路，诱导损伤细胞凋亡[16]，心肌细胞凋亡后会继续发生心肌重构，最终导致慢性心力衰竭的发生[5]。

目前对高Hcy的防治主要策略是在食物或药物中加用叶酸及维生素B12加速其代谢[17]，这类治疗策略的显著特点是以降低血清Hcy水平为目的。近来一些临床相关的Meta分析显示，补充叶酸治疗可以降低脑血管事件，但并不能降低心血管事件的风险[18]。因此需要探索新的手段对临床高Hcy进行干预。4-PBA作为一种小分子脂肪酸，起初应用于镰状细胞贫血和地中海贫血的临床治疗，近年研究证实其为一种分子伴侣，可逆转未折叠蛋白和错误折叠蛋白而减轻ERS，在本实验中，我们对同样为血清高浓度Hcy的4-PBA组小鼠给予4-PBA干预，目的是通过阻断ERS通路后，检测ERS相关因子的表达，结果显示其ERS相关因子CHOP、ERO1α表达确有下降，电镜下内质网结构也确有改善，再次证实高Hcy血症触发了ERS而介导的心肌损伤。其机制可能是4-PBA作为分子伴侣，协助信号分子指导蛋白折叠，减轻ERS负担，从而抑制 CHOP以及其下激分子ERO1-α转录和翻译，减轻心肌细胞凋亡，发挥心肌保护作用[19]。4-PBA干预后出现细胞超微结构及分子水平的改变进一步佐证Hcy通过ERS介导心肌损伤，并提示阻断ERS可能为干预Hcy所致心脏病的一个新靶点[20]。

此外我们的研究仍然存在不足之处，如未设计正常饲料喂养组并经4-PBA组，无法说明4-PBA对心肌单独效应；未进一步探讨CHOP及ERO1α经过何种改变导致表达增加，如是否和基因的乙酰化和甲基化过程相关等，以上不足。我们将会在后续的细胞实验中加以完善。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突