IL-8与FeNO 在不同炎症表型的咳嗽变异性哮喘患者中的水平及临床意义

张星慧 常晓悦

包头市中心医院呼吸科014040

咳嗽变异性哮喘 (cough variant asthma,CVA)的主要或唯一的临床常见表现是慢性咳嗽,这种咳嗽常发生在夜间和凌晨,咳嗽持续时间一般会超过8周,且无明显的气喘、呼吸急促等典型哮喘症状,在国内多中心调查研究发现CVA 气道的高反应性咳嗽约占慢性咳嗽原因的1/3,但常因胸片无明显异常体征,临床上容易被误诊,从而错过早期干预的最佳时机,因此对CVA 早期诊治具有重要的临床意义[1]。国内学者研究发现,随着病情发展约有34%～73%的CVA 患者经数年后会发展成为典型的哮喘[2-3],CVA 其实是典型哮喘的前期状态或轻微哮喘,同典型哮喘的病理生理相似,是一种由多种炎症细胞参与的慢性气道炎症性疾病,依据诱导痰分类标准,将哮喘气道浸润炎症细胞分为:中性粒细胞 (neutrophil,Neu)、嗜酸粒细胞(eosinophil,Eos)、混合细胞 (mixed granulocyte,Mix)、寡粒细胞(pauci-granulocytic,Pau)4型,CVA 患者的气道存在高反应,也有神经调节参与等,因此用支气管扩张剂或茶碱等治疗CVA 患者会有一定的疗效,目前临床中常应用吸入性激素联合吸入性支气管扩张剂来治疗CVA,但治疗中发现有一部分CVA 患者对上述药物并不敏感[4],这引起研究者好奇,进一步分析原因发现其气道浸润的细胞以Neu为主,因此了解中性粒细胞型CVA的发病机制,对于CVA 早期预防及治疗有重要意义,在此基础上进一步研究CVA 气道炎症表型,推测不同炎症表型可能存在不同病理生理机制。Hosoki等[5]研究也发现,IL-8浓度与肺泡灌洗液中的Neu百分比显著相关,此外还发现与第1秒用力呼气容积占预计值百分比 (forced expiratory volume in one second as a percentage of expected value,FEV1%pred)呈负相关,提示IL-8可反映肺功能下降程度[6-8]。FeNO 测定可能间接反映气道Eos炎症水平[9],这对CVA 炎症表型的治疗和早期临床干预有重大意义我们的实验主要通过研究不同炎症表型CVA 患者与FeNO、IL-8这两个指标之间关系,推测它们在不同炎症表型CVA 病理生理中的具体可能机制,可以使临床医师不仅对CVA 病理生理有了深入了解,同时也可以帮助临床医师对不同炎症表型的CVA 进行进一步鉴别,为不同炎症表型CVA 患者进行针对性治疗提供可能,同时IL-8拮抗剂为CVA 患者的靶向治疗提供可能[10-12]。

1 对象与方法

1·1 研究对象

1·1·1 病例组 随机选取就诊于包头市中心医院呼吸科门诊及住院的病例。诊断为CVA 患者87例,男49 例,女38 例,年龄 (39.93±10.58)岁,年龄范围为18～64岁。分别为Neu组患者21例,男8 例,女13 例;Eos组患者45 例,男20例,女25 例;Mix 组患者13 例,男8 例,女5例;Pau组8例,男3例,女5例。

入选及排除标准:均须符合中华医学会呼吸病学分会2009 年制订的 《咳嗽的诊断与治疗指南》中CVA 的诊断标准,排除标准[1]。

1·1·2 健康对照组 同期选择本院体检健康者25人,男/女人数分别为12/13人,年龄范围为21～51岁,为对照组。

1·2 方法

1·2·1 检查 所有人员安静状态下进行检查,FeNO 及肺功能测定,于清晨取外周静脉血2 ml,送酶联免疫荧光法定量测定血清IgE浓度。采用酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测IL-8的含量。

1·2·2 峰速仪的使用方法 将透明口与峰速仪接口部套紧,然后将分流速仪的红色游标指针轻轻拨到标尺刻度最低处,一开始先尽量吸足气,然后将嘴唇严密的包住透明口部(注意在吹气过程中不能漏气),然后快速的在最短的时间内用力将气一下子吹出、吹净,这时将红色游标针会一下移动到一定刻度位置,在此刻度处记录下来的数值就是你的最高呼气流量 (peak expiratory flow rate,PEF)值(如果进行重复测试时需要将红色的游标指针归位到最初的位置处),PEF 测定时间为每天早、晚,每个时间分别测试3次,选择最高一次PEF,与测试的日期、时间,一起记录在测试记录表中,每次测试后将峰速仪进行妥善保管,根据每日所测PEF来推算日间变异率。公式为:PEF变异率=2(PEF 晚间值-PEF 早晨值)/ (PEF 晚间值+PEF早晨值)×100%,最常用连续监测2周,将每天的变异率相加除以监测天数,以监测天数(最少7 d)计算PEF平均变异率。依此判定患者肺功能监控情况。

1·2·3 诱导痰及分型 入组的检查者在清洁漱口后超声雾化吸入3%～5%氯化钠溶液,每3～5分钟嘱用力咳嗽,直至咳出痰液,最长不超过20 min。痰咳于无菌培养皿中,向痰液内加入4倍体积的0.1%的二硫苏糖醇,涡旋震荡10 min;再加等量磷酸盐缓冲液震荡5 min,离心半径15 cm,2 000 r/min,离心10 min;制作细胞涂片,空气中自然晾干。痰涂片用Wright氏染色液染色。然后在光镜下进行细胞学分类并计算细胞总数、各细胞及各种炎性细胞 (Eos、Neu、Mix、Pau)百分比。光镜下进行200个非鳞状细胞分类。(合格痰标本的标准:低倍镜下白细胞与上皮细胞比例＜2.5)哮喘炎症表型分类根据诱导痰细胞学分类标准之一:进行分组分别为Eos组 (诱导痰中Eos比例≥3%),Neu 组 (诱导痰中Neu 比例≥64%),Mix组 (诱导痰中Neu 比例≥64%,Eos比例≥3%),Pau 组 (诱导痰中Eos比例＜3%,Neu比例＜64%)。

1·2·4 血清IL-8 测定 使用一次性空针采集CVA、对照组人员空腹静脉血2 ml,注入干燥的灭菌试管内(避免溶血),室温下血液自然凝固10～20 min,离心20 min (以2 000～3 000 r/min,离心半径为15 cm),仔细收集上清于另一干净EP管中,置-20 ℃冻存待检。保存过程中如出现沉淀,应再次离心。采用ELISA 法检测IL-8的含量。采用ELISA 法检测。标准品经过稀释、加样、温育、洗涤、加酶再次温育、洗涤、显色等步骤:最后测定,以空白空调零,450 nm 波长依序测量各孔的吸光度(original date,OD )值。测定应在加终止液后15 min以内进行。根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度,再乘以稀释倍数,通过标准曲线计算样品中IL-8的浓度。

1·3 统计学分析 所得数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析,统计描述中,所有计量资料采用Kolmogorov-Smirnov检验法进行正态检验,符合正态分布的定量资料采用±s 表示,不符合正态分布的资料采用M(QR)表示;定性资料以频数和构成比表示。多组计量资料间服从正态分布和方差齐同的条件,采用单因素方差分析,并用SNK-q 法进行组间比较;方差不齐,采用Kruskal-Wallis 检验比较,进行两两比较采用Wilcoxon秩和检验。多个样本率比较采用行列表资料χ2检验,双变量服从正态分布的采用Pearson相关分析分析相关性,不符合则使用Spearman秩相关分析。α=0.05。

2 结果

2·1 基本资料数据 本研究共纳入Neu组患者21例,男8 例,女13 例;Eos组患者45 例,男20例,女25 例;Mix 组患者13 例,男8 例,女5例;Pau组型8 例,男3 例,女5 例;对照组25例,男10例,女15 例。比较5 组实验者基本资料,结果发现5组实验者分别在年龄、性别、体质量、FEV1/FVC水平方面差异无统计学意义(Z=3.012、2.223、5.077、3.951、6.912,P 值均＞0.05),Eos组与对照组在身高方面有差异,除了Pau组外,其余3组的FEV1%pred、75%肺活量位最大呼气流速 (75% maximal mil-expiratory flow,MEF75)、50% 肺活量位最大呼气流速(50% maximal mid-expiratory flow,MEF50)分别与对照组比较差异均有统计学意义 (Z =-2.130、-2.585、-3.354、-5.680、-2.606、-3.581、-3.309、-3.301、-2.146,P 值均＜0.05),而且Neu组、Eos组的MEF75 与Pau组比较,差异均有统计学意义 (Z = -2.585、-3.016,P 值均＜0.05)。见表1。

2·2 血清IL-8浓度比较 Neu组、Eos组、Mix组、Pau组、对照组IL-8浓度比较 比较5 组间IL-8浓度,发现5组间差异有统计学意义 (H =55.840,P ＜0.001)。分别进行两两比较时,Neu组和Mix组IL-8浓度分别高于对照组、Eos组和Pau组3组,差异均有统计学意义(Z=-5.447、-3.660、-5.392、-3.968、-3.331、-4.785,P 值均＜0.05)。Neu组与Mix组比较有差异,差异有统计学意义(Z=-2.357,P ＜0.001)。Eos组与对照组比较,差异有统计学意义 (Z =-2.305,P ＜0.05)。其他组间两两比较,差异无统计学意义 (Z =-1.071、-0.735,P 值均＞0.05),表明无论是Neu组还是Mix组IL-8 浓度相对于Pau组和对照组明显升高,说明IL-8参与CVA 患者的气道炎症形成,同时与炎症所在的表型有一定联系。见图1、表2。

图1 Neu 组、Eos组、Mix 组、Pau 组及对照组5 组间IL-8浓度

表1 5组主要基本临床特点的比较

2·3 血清总IgE浓度及呼出气一氧化氮 (fraction of exhaled nitric oxide,FeNO)值比较 Neu组、Eos组、Mix组、Pau组、对照组IgE 值的比较 因为Neu和EoS组血清Ig E 浓度值不服从正态分布,所以采用Kruskal-Wallis检验比较5组的血清Ig E的浓度,发现5组间存在差异,且差异有统计学意义(H =24.590,P ＜0.001)(表3)。进行两两比较时,Eos组和Mix组与其他3组比较差异均有统计学意义 (Z = -2.751、 -2.484、-4.497、-1.050、-2.277,P 值均＜0.05),Eos组与Mix组比较也有差别,差异有统计学意义(Z =-2.158,P ＜0.05)。见表3、图2。

表2 Neu组、Eos组、Mix组、Pau组、对照组IL-8浓度的比较

表3 Neu组Eos组Mix组Pau组对照组Fe NO 的IgE水平比较 [M(QR)]

图2 Neu组、Eos组、Mix组、Pau组、对照组IgE 值的比较

Neu组、Eos 组、Mix 组、Pau 组、对照组FeNO 值的比较 因对照组中FeNO 值也不服从正态分布,采用Kruskal-Wallis检验比较,Fe NO 在5组间进行总体对比时,发现FeNO 值在5组间不同或不全相同,5组间进行两两比较,结果Eos组和Mix组的FeNO 值明显高于其他3组,差异有统计学意义 (Z =-3.846、-3.130、-6.225、-3.739、-3.586、-5.003,P 值均＜0.05)。Eos组和Mix 组比较差异无统计学意义 (Z =-0.137,P ＞0.05),其他组间进行两两比较,差异均无统计学意义 (Z = -0.415、-0.355、-0.416,P 值均＞0.05)。见图3。

图3 Neu组、Eos组、Mix组、Pau组、对照组FeNO 值的比较

2·4 FeNO 测定值与基本资料相关性研究 因国内外研究发现,FeNO 测定值会受到上述基本资料的影响,如年龄、性别、身高、体质量等,因此需要对CVA 患者的FeNO 进行进一步分析,分析与年龄、性别、身高、体质量以及肺功能等各项指标值间有无相关性。同时也进一步研究CVA 患者的IL-8浓度是否也会受到上述指标影响。见表4。

表4 CVA 的FeNO 与各指标相关分析

在对CVA 患者进行相关性分析时,考虑到FeNO 值是否受一些因素影响,如IL-8 浓度,年龄、身高、体质量、Ig E、FEV1%pred、MEF75、MEF50。由表4得出CVA 患者FeNO 值与身高、体质量、Ig E、FEV1%pred、MEF75、MEF50 有相关性(P ＜0.05),与年龄、IL-8浓度无相关性(P ＞0.05)。因同样是炎症指标,我们进一步去探究CVA 患者IL-8是否与上述指标有相关性,分析后发现IL-8浓度不受年龄、身高、体质量等的影响,与这些指标间无相关性 (P ＞0.05),IL-8与MEF75呈负相关 (r =-0.225,P ＜0.05),见表5。

表5 CVA 的IL-8与各项指标相关分析

3 讨论

以上研究结果显示,无论是Eos组还是Mix组,呼出气的Fe NO 值均高。这与国内研究结果相似,就是当CVA 患者痰液中Eos增多,或者BALF中Eos增高时,患者FeNO 水平也会相应高于健康者[2,13],说明FeNO 值在一定程度上可能能够协助以Eos参与为主的气道炎症的判断。研究发现IL-8在Neu组中和Mix组中浓度较其他几组高,差异有统计学意义,血清IL-8水平可能会间接反应出Neu相关的气道炎症,Hosoki等[5]研究显示,IL-8浓度与肺泡灌洗液中的Neu百分比显著相关,Neu的百分比和肺泡灌洗液中IL-8浓度均与FEV1%pred呈负相关,这些研究进一步证明血清IL-8可能与Neu关系密切。在上述研究中发现Fe NO 值在Eos组、Mix 组中无差别,而后发现IL-8浓度在Eos组中低于Mix组,这个研究发现检测FeNO 同时联合检测血清IL-8浓度,以后有可能用炎症指标可以对Neu 组、Eos组及Mix组这3组进行区分,为不能配合诱导痰操作进行炎症分型患者提供有一定意义的理论依据,从而也进一步了解Mix组患者产生炎症的机制,为其进行合理的临床治疗及未来的靶向治疗提供依据。国内外研究发现,Fe NO 测定会受到年龄、身高、性别、体质量等因素的影响,以上数据结果显示FeNO 与体质量和身高有一定相关性,这与目前全球关于FeNO 测定在CVA 中的临床意义研究结论是相同的,因此目前FeNO 测定在诊断CVA 中只能起辅助参考作用,但从实验结果来看,在鉴别Eos在参与的气道炎症时有重要参考价值,同时研究中还发现CVA 组中IL-8浓度与年龄、身高、体质量没有相关性,说明血清IL-8浓度可能不受这些因素的影响,在与肺功能指标中进行相关性分析时,血清IL-8浓度与MEF75呈负相关,与其他指标不相关,也说明这两项炎症指标可能与小气道功能异常有关联。理解Fe NO 和血清IL-8在不同炎症表型CVA 中的作用机制,能有力的推动免疫干预和治疗不同炎症CVA 疾病的能力。监测FeNO和血清IL-8水平可能成为一种便捷、安全、有效区分CVA 炎症状态的指标,也可能早期的辨别出CVA 所在的炎症状态,从而可以对其进行早期的干预,为早期的防止疾病进展提供可能。由于这两项炎症指标在CVA 研究中的初始探索阶段,且研究中一些组的样本量相对较少,结果可能存在误差,需要加大样本量进行更深入的研究,有可能会进一步发现其在CVA 中的病理生理机制及临床中的实际意义。并且进一步分析出这两项炎症指标在不同炎症表型中的可能阈值,为CVA 患者的早期诊断、分型及治疗提供依据。Eos是参与CVA 的发病的主要炎症细胞之一[2,13-14],在CVA 发病的病理生理过程中有重要作用。研究表明,不同炎症表型CVA 患者气道炎症中其所含相关炎症细胞及炎症因子比例也不同,因此我们进行一些不同炎症表型CVA 患者气道炎症标志物及血清中相关炎症介质(Fe NO 测定与IL-8)的比较研究,以探讨其在不同炎症性疾病中的作用机制,为CVA 早期诊断提供理论依据,同时进一步对其所处的炎症表型进行分析,为不同炎症表型CVA 患者进行针对性治疗提供依据。即使FeNO 测定代替不了支气管激发试验诊断CVA 金标准的位置,但它可以成为一种具有无创性、便利性、可重复性及灵敏度高的监测气道炎症的一种标志物,因为气道炎症诊断的金标准依赖于支气管肺泡灌洗和支气管内膜活检,但其操作过程中创伤度大,患者配合难度高,费用高及并发症危险等问题,一直难以被患者接受。然而Fe NO 测定对技术人员及受试者要求低、没有年龄段限制,测试方法通俗易懂,所以FeNO 具体临床价值值得更加深入的研究和探索。

总之,我们可以认为FeNO、IgE及IL-8参与了不同表型CVA 患者的发病,参与了CVA 的病理生理过程,目前FeNO 作为一项简单快捷的测定气道所处炎症状态的标志物,而广泛用于临床。研究发现在以Eos浸润为主气道炎症中其血清IgE值也较其他组高,我们联合FeNO 及Ig E 进一步去分析其Eos为主患者气道炎症机制,有可能发现其早期炎症表型,然后进行及时干预和治疗。血清IL-8水平可反映CVA 患者的另一种气道炎症状态,靶向IL-8 可作为新的靶向药物治疗,同时FeNO 也能够用于监测CVA 患者的抗炎治疗疗效。联合所有的检测指标,进一步研究其在不同炎症表型CVA 患者的气道炎症中的病理生理作用可能会有新的意外的发现,同时更有助于探索新靶点及干预措施。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突