COPD 大鼠肺组织和骨骼肌中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量变化

贺佳林 胡瑞成 戴爱国

1深圳市龙华区人民医院呼吸内科518109;2湖南省人民医院呼吸内科,长沙410016;3长沙医学院410000

COPD 其病变与慢性支气管炎(杯状细胞黏液分泌过多与黏膜下腺增生)、肺气肿 (气道实质性破坏)、肺间质纤维化和小气道的炎症相关联,COPD 肺组织的慢性炎症发生、发展过程中存在着氧化应激反应,多种炎症细胞和细胞因子参与其COPD 的形成过程[1-3]。近年来COPD 导致骨骼肌萎缩的改变其相关分子机制引起人们的高度关注,其中涉及各种细胞因子介导的全身炎症反应、氧化应激、线粒体功能障碍等因素[4]。本研究通过被动吸烟致大鼠COPD 模型探讨COPD 形成过程中肺组织和肺外组织、外周血、骨骼肌中活性氧(reactive oxygen species, ROS)、 丙 二 醛(malondialdehyde,MDA)、IL-6和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量的改变。

1 材料与方法

1·1 实验动物 选择健康8周龄SPF 级雄性SD大鼠20只,体质量 (184.05±13.61)g。动物购于长沙天勤生物技术有限公司,由湖南省动物检疫二站检验合格,许可证书编号:SCXK (湘)2009-0012。将实验用大鼠置于标准饲养房喂养,昼/夜12/12 h,温度22℃左右,湿度60%～70%,自由饮水进食,本研究符合《赫尔辛基宣言》的原则。

1·2 仪器和试剂 主要仪器:小动物呼吸机 (江西省特力麻醉呼吸设备公司),光学显微镜及照相系统(日本Olympus公司),紫外/可见光分光光度计(美国Perkin Elmar公司),精密分析天平(瑞士Mettler公司),-80 ℃超低温冰箱 (日本Sanyo公司),低温台式离心机 (长沙鑫奥仪器仪表有限公司),全自动酶标洗板机 (汇松PW-812),多功能酶标分析仪 (汇松MB-530)。主要试剂:芙蓉牌香烟(湖南中烟工业有限责任公司,尼古丁1.0 mg/支,焦油12 mg/支);ROS检测试剂盒 (酶联生物),MDA 检测试剂盒 (南京建成生物工程研究所),TNF-α 检测试剂盒 (美国Multi Sciences 公司),IL-6 检测试剂盒 (美国Multi Sciences公司)。

1·3 建立COPD 动物模型 按照随机数字表法将大鼠随机分为COPD 模型组和对照组,每组10只。参考彭艳[5]的方法建立COPD 大鼠模型:每天将COPD 模型组大鼠置于专用被动式吸烟装置(60 cm×60 cm×40 cm)内,采用单纯被动吸烟方法将香烟(芙蓉王牌)置于被动式吸烟装置底部燃烧形成烟雾,被动吸烟期间保持装置中含氧量为18%左右。每天单纯被动吸烟8次共计20支,上午和下午分别吸4次,每次间隔1 h,持续被动吸烟4个月后建立COPD 大鼠模型。对照组大鼠置于相同另一被动吸烟装置内不给予特殊处理,其时间和环境条件与实验组一致。被动吸烟过程中大鼠易聚堆,可利用长条驱散。持续被动吸烟4个月以后,在中南大学医学院生理学实验室采用小动物呼吸机对大鼠肺功能进行检测确认COPD 模型建立成功,采集支气管肺泡灌洗液、肺中叶组织、外周全血和外周肌中的小腿伸趾长肌作为本实验的标本。

1·4 观察指标 (1)肺组织HE染色观察肺组织病理改变;(2)小动物呼吸机测定肺功能;(3)硫代巴比妥酸法测定支气管肺泡灌洗液、肺组织匀浆上清液、外周血血清和骨骼肌匀浆上清液MDA 含量,按试剂盒说明书进行检测;(4)酶联免疫吸附试验法测定支气管肺泡灌洗液、肺组织匀浆上清液、外周血血清和骨骼肌匀浆上清液ROS、IL-6和TNF-α的含量,按试剂盒说明书进行检测。

1·5 统计学分析 采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析。计量资料以±s 表示,组间比较采用t检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2·1 大鼠肺组织病理改变比较 大鼠肺组织经HE染色,在光学显微镜下观察肺组织形态学改变,结果可见模型组4个月后肺组织形态学表现出典型的COPD 病理改变:大量肺泡融合,肺泡壁变薄、破裂,炎症细胞大量浸润,有典型肺气肿表现提示COPD 大鼠模型建立成功。对照组肺泡结构正常,管腔内未见渗出物,肺泡腔未见病理性扩大,见图1。

图1 大鼠肺组织病理改变 HE ×100 A:COPD模型组;B:对照组

2·2 大鼠肺功能的改变 对COPD 模型组与对照组大鼠进行肺功能指标最大呼气量 (peak expiratory flow,PEF)、0.3秒用力呼气容积(forced expiratory volume in 0.3 second,FEV0.3)和FEV0.3/FVC 的测定,模型组大鼠肺功能指标PEF、FEV0.3和FEV0.3/FVC与对照组肺功能指标比较显著降低,两者之间差异有统计学意义 (t=13.58、7.71、13.87,P 值均＜0.001),提示小气道气道阻力增加、残气量增加,存在明显气流受阻、阻塞性通气功能障碍的变化。对照组未见肺功能气道阻力和残气量增加的变化。检测结果进一步支持本实验建立的被动吸烟致大鼠COPD 模型成立,见表1。

表1 大鼠肺功能指标的测定结果 (±s)

表1 大鼠肺功能指标的测定结果 (±s)

注:PEF为最大呼气量;FEV0.3为0.3秒用力呼气容积

组别鼠数PEF(ml/s)FEV0.3(ml)FEV0.3/FVC(%)COPD 模型组10 23.89±2.49 3.68±0.28 62.48±3.54对照组10 43.06±4.49 4.77±0.33 83.14±3.11 t 值13.58 7.71 13.87 P 值＜0.001＜0.001＜0.001

2·3 大鼠支气管肺泡灌洗液中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的测定 通过对COPD 模型组与对照组大鼠支气管肺泡灌洗液中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的测定结果表明,COPD 模型组中支气管肺泡灌洗液中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量均出现明显增高,与对照组比较差异有统计学意义 (t=30.135、16.489、26.549、25.346,P值均＜0.001),见表2。

2·4 大鼠肺组织匀浆中ROS、MDA、IL-6 和TNF-α含量的测定 通过对COPD 模型组与对照组大鼠肺组织匀浆中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的测定结果分析,COPD 模型组与对照组比较,肺组织中ROS、MDA、IL-6 和TNF-α 含量均出现明显增高,差异有统计学意义 (t =25.632、15.551、23.422、27.319,P 值均＜0.001),见表3。

2·5 大鼠外周血血清中ROS、MDA、IL-6 和TNF-α含量的测定 通过对COPD 模型组与对照组大鼠外周血血清中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的测定结果分析,COPD 模型组外周血血清中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量均出现明显增高,与对照组比较差异有统计学意义 (t =24.146、10.905、17.327、24.243,P 值均＜0.001),见表4。

表2 大鼠肺泡灌洗液中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的测定结果 (±s)

表2 大鼠肺泡灌洗液中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的测定结果 (±s)

注:ROS为活性氧;MDA 为丙二醛;TNF-α为肿瘤坏死因子-α

组别鼠数ROS (×103 U/L)MDA (μmol/L)IL-6 (ng/L)TNF-α(ng/L)COPD模型组10 89.67±7.02 25.29±2.46 65.58±6.59 62.81±5.92对照组10 18.37±2.59 9.96±1.61 13.48±2.02 11.61±2.40 t值30.135 16.489 26.549 25.346 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

表3 大鼠肺组织匀浆中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的测定结果 (±s)

表3 大鼠肺组织匀浆中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的测定结果 (±s)

注:ROS为活性氧;MDA 为丙二醛;TNF-α为肿瘤坏死因子-α

组别鼠数ROS (×103 U/g)MDA (μmol/g)IL-6 (ng/g)TNF-α(ng/g)COPD模型组10 90.24±8.15 25.22±2.42 63.94±6.55 83.70±7.35对照组10 18.25±3.46 9.93±1.95 12.62±2.26 14.31±3.24 t值25.632 15.551 23.422 27.319 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2·6 大鼠骨骼肌组织匀浆中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的测定 通过对COPD 模型组与对照组大鼠骨骼肌匀浆中ROS、MDA、IL-6 和TNF-α含量的测定结果分析,COPD 模型组骨骼肌组织中ROS、MDA、IL-6 和TNF-α含量均出现明显增高,与对照组比较差异有统计学意义(t=18.082、7.573、15.832、21.206,P 值均 ＜0.001),见表5。骨骼肌中IL-6与血、肺及支气管肺泡灌洗液中IL-6 的相关性分析结果呈正相关,相关系数分别为r=0.923、0.964、0.942;骨骼肌中TNF-α水平与血、肺及支气管肺泡灌洗液中TNF-α的相关性分析结果呈正相关,其相关系数分别为r=0.913、0.966、0.935。

3 讨论

研究表明COPD 的特征性病理性改变存在肺组织小气道、肺实质及肺血管的慢性炎症反应,多种炎症细胞包括中性粒细胞、巨噬细胞及T 淋巴细胞被激活后,可释放一些致炎性细胞因子主要包括IL-6、IL-8、TNF-α等,这些细胞因子可介导炎症反应的启动[6-8]。在炎症过程中产生的自由基如超氧阴离子自由基和羟基自由基可诱发氧化应激反应,引起细胞的脂质过氧化,从而进一步导致肺组织结构的破坏,引起肺气肿、外周气道的炎症和水肿、黏液过度分泌和纤维化。

ROS包括超氧阴离子自由基、羟基自由基以及过氧化氢等。ROS主要由中性粒细胞、嗜酸粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等激活的炎症细胞产生,当ROS生成过多时,可导致脂质、蛋白质和DNA 过氧化。ROS对肺泡Ⅱ型上皮细胞具有一定的溶解作用,可减弱上皮细胞参与损伤后修复的能力,影响细胞外基质重建。MDA 是脂质过氧化的主要产物之一,通过测定MDA 可以了解细胞膜脂质过氧化和细胞膜受损的程度。文献报道在COPD患者肺泡灌洗液和肺组织中可检测到超氧阴离子自由基和过氧化氢等ROS增加,ROS的增多与肺泡中性粒细胞、巨噬细胞活化有关。COPD 患者的肺组织中检测到脂质过氧化的主要产物MDA 表达增多[9-10]。罗勇等[11]通过大鼠被动吸烟方式实验结果显示烟熏后大鼠气道炎性细胞浸润,气道发生异常炎症反应。同时远隔气道组织的骨骼肌也存在脂质过氧化损伤,烟熏12 周以上的大鼠骨骼肌组织MDA 显著升高。

IL-6是一种主要由活化的巨噬细胞、单核细胞、内皮细胞、T 和B 淋巴细胞及成纤维细胞等分泌的具有多种生物学功能的细胞因子,IL-16是炎症反应的早期启动因素,是COPD 发病过程中的重要炎性细胞因子之一。文献报道COPD 患者痰液和血清中IL-6水平明显增多,且与FEV1%pred呈负相关。COPD 患者血清IL-6水平在治疗前明显高于正常人,且血清IL-6水平与COPD 的病情严重程度密切相关,随气道受限严重程度增高而显著升高[7-8]。朱木林等[12]通过检测COPD 合并外周骨骼肌障碍的患者血浆IL-6、IL-8水平结果显示COPD合并外周骨骼肌障碍的患者血浆IL-6、IL-8水平显著高于COPD 无骨骼肌障碍组和对照组。

表4 大鼠外周血血清中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的测定结果 (±s)

表4 大鼠外周血血清中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的测定结果 (±s)

注:ROS为活性氧;MDA 为丙二醛;TNF-α为肿瘤坏死因子-α

组别鼠数ROS (×103 U/L)MDA (μmol/L)IL-6 (ng/L)TNF-α(ng/L)COPD模型组10 68.52±6.21 19.43±2.31 45.49±5.24 62.80±5.35对照组10 18.24±2.19 9.72±1.61 13.29±2.66 15.59±3.05 t值24.146 10.905 17.327 24.243 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

表5 大鼠骨骼肌组织匀浆中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的测定结果 (±s)

表5 大鼠骨骼肌组织匀浆中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量的测定结果 (±s)

注:ROS为活性氧;MDA 为丙二醛;TNF-α为肿瘤坏死因子-α

组别鼠数ROS (×103 U/g)MDA (μmol/g)IL-6 (ng/g)TNF-α(ng/g)COPD模型组10 56.63±6.43 16.41±2.25 42.43±4.89 52.60±4.58对照组10 18.20±2.06 9.77±1.62 14.44±2.71 15.21±3.18 t值18.082 7.573 15.832 21.206 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

TNF-α主要是由脂多糖刺激巨噬细胞而分泌具有多种生物活性的炎性细胞因子,TNF-α可促进炎性细胞黏附、游走和浸润,破坏溶酶体导致溶酶体酶的释放,从而损伤肺泡上皮细胞,破坏肺组织结构。TNF-α通过激活核因子κB,促使IL-6、IL-8 m RNA 的转录与IL-6、IL-8 表达增加,TNF-α可通过产生的IL-6和IL-8等细胞因子引起炎症反应[13-14]。对COPD 急性发作期的患者进行研究结果显示,急性期血清TNF-α水平明显增高,缓解后TNF-α 水平有所下降,TNF-α 水平与FEV1%pred 和FEV1/FVC 呈负相关,与肺功能受损程度呈正相关。何大川等[15]研究发现,COPD合并外周骨骼肌障碍患者血清炎症因子TNF-α和IL-8水平显著高于COPD 非萎缩组和健康组,COPD 萎缩组患者血清IL-8及TNF-α与运动耐力和肺功能均呈负相关。

本研究COPD 模型组经肺组织病理检测和肺功能测定均支持本实验建立的连续被动吸烟4个月致大鼠COPD 模型成立。通过测定支气管肺泡灌洗液、肺组织匀浆上清液、外周血血清和骨骼肌匀浆上清液中ROS、MDA、IL-6 以及TNF-α 的含量结果显示,被动吸烟大鼠4 个月COPD 形成过程中支气管肺泡灌洗液、肺组织匀浆上清液、外周血血清和骨骼肌匀浆上清液中ROS、MDA、IL-6以及TNF-α的含量均呈现显著增高的表现,与对照组比较差异有统计学意义 (P ＜0.001);且骨骼肌中IL-6和TNF-α水平与支气管肺泡灌洗液、肺及血中IL-6和TNF-α水平呈正相关。该结果提示当COPD 形成过程中肺组织和外周骨骼肌组织中存在炎性细胞因子IL-6和TNF-α介导的氧化应激反应。骨骼肌组织中炎症反应如何促进骨骼肌蛋白分解增多,破坏骨骼肌蛋白的合成与分解的平衡,进而引起COPD 骨骼肌萎缩的发生有待进一步深入研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突