HCV基因分型、AFP-L3与P53抗体联合检测在HCV相关肝细胞癌中的诊断价值

杨自力， 张任飞， 何 欣， 张 洁， 万 祎

绵阳市第三人民医院(四川省精神卫生中心) a. 检验科； b. 肝胆外科， 四川 绵阳 621000

HCV慢性感染可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)[1]。据世界卫生组织[2]估计，2015年全球有7100万人慢性HCV感染，约40万人死于HCV感染引起的肝硬化或HCC。HCV 1b基因型是发生HCV相关HCC(HCV-HCC)的高危因素[3]。P53抗体是较为明确与HCC发生有关的肿瘤相关抗原自身抗体[4]。HCC的早期诊断可以显著提高患者的生存率，但早期诊断目前仍然是HCC诊治技术的重点和难点。我国《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》[5]明确指出：甲胎蛋白异质体(alpha-fetoprotein-L3, AFP-L3)可作为肝癌早期诊断标志物，特别是对于AFP阴性人群。近年来，血清AFP-L3联合其他指标早期诊断HCC已成为研究热点[6-7]，但HCV-HCC早期诊断的相关研究并不多见。本研究结合HCV基因型、AFP-L3(%)及P53抗体，探讨三者联合检测对HCV-HCC的早期诊断价值。

1 资料与方法

本研究严格按照国际《TRIPOD声明》[8]报告清单格式撰写。

1.1 研究对象 选取2016年1月-2019年12月在绵阳市第三人民医院就诊的丙型肝炎患者、HCV肝硬化患者及HCV-HCC患者。根据是否伴有HCC分为HCV-良性肝病组和HCV-HCC组。纳入标准：HCV-良性肝病组符合《丙型肝炎诊断WS213-2018》[9]的标准，依据HCV RNA阳性结果做出确诊。对于抗-HCV阴性、HCV RNA阳性患者，均结合临床，必要时重新采血复查。对于确诊丙型肝炎患者，根据流行病学史、临床表现、肝组织病理学检查、影像学及其他辅助检查的相关肝炎及肝硬化典型表现诊断。HCV-HCC组中HCC诊断标准符合《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》[10]：结合临床结节大小、影像学检查(MRI/CT/CEUS/EOB-MRI)与穿刺活检的相关肝癌典型表现诊断HCC。HCC中确诊合并HCV感染的列为研究对象。排除标准:合并其他病毒性肝炎、HBV/HCV混合感染、自身免疫性疾病及拒绝参加临床试验的人群均不列为研究对象。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 以真空不抗凝采血管采集所有受试者晨起的空腹静脉血两管，每管3～5 ml，室温静置15～30 min，离心机3000 r/min离心10 min，留取血清转移至另一清洁的EP管内，置于-70 ℃冰箱保存待用，统一检测。

1.2.2 HCV基因分型检测 采用PCR-反向点杂交技术进行HCV基因分型，仪器为Prism7300荧光定量PCR仪(美国ABI公司)、电恒温震荡水槽，试剂由中山大学达安基因股份有限公司提供。

1.2.3 血清AFP-L3(%)测定 AFP-L3分离采用微量离心柱法,AFP采用电化学发光法,使用德国罗氏诊断公司 Cobase601分析仪及配套试剂；AFP-L3采用北京热景生物技术有限公司AFP-L3亲和吸附离心管分离。计算AFP-L3占总AFP 的比例，以AFP-L3≥10%作为阳性标准。

1.2.4 血清P53抗体测定 采用ELISA方法，试剂使用海联生物生产的抗P53(IgG)ELISA检测试剂盒，严格按说明书操作。以0.25～8.0 ng/ml作为参考范围。

1.3 样本量估算 采用AFP-L3(%)与P53抗体为主要评价指标，以样本量计算软件PASS 15的诊断试验[基于两个受试者工作特征曲线(ROC曲线)下面积(AUC)]进行样本量初步评估[11]。根据预实验结果：AFP-L3(%)与P53抗体的AUC大致为0.75与0.85。取α=0.05、β=0.2，估算最小样本量为阳性组79个样品和阴性组79个样品。估计失访率为5%。

1.4 伦理学审查 本研究经绵阳市第三人民医院伦理委员会批准[编号2018审(003)]，所有研究对象均签署知情同意书。

2 结果

2.1 一般资料 最终纳入HCV-良性疾病组、HCV-HCC组患者均84例。HCV-良性肝病组与HCV-HCC组性别构成比相似(P=0.079)。HCV-HCC组的平均年龄高于HCV-良性肝病组，差异有统计学意义(P<0.001)；HCV-良性肝病组ALT、AST水平均高于HCV-HCC组，差异有统计学意义(P值均<0.001)；HCV-良性肝病组与HCV-HCC组的HCV基因型分布差异有统计学意义(P=0.037)(表1)。

表1 两组患者一般资料

2.2 两组患者AFP-L3(%)、P53抗体、HCV 1b基因型(%)差异 血清AFP-L3(%)水平在HCV-良性肝病组和HCV-HCC组分别为17.50(11.00～23.00)和88.00(35.25～122.00)，差异有统计学意义(Z=-9.27，P<0.001)。血清P53抗体水平在HCV-良性肝病组和HCV-HCC组分别为6.90(3.80～11.40) ng/ml和55.00(23.00～77.00)ng/ml，差异有统计学意义(Z=-9.92，P<0.001)。血清HCV 1b基因型在HCV-良性肝病组和HCV-HCC组分别为45例(54%)、60例(71%)，差异有统计学意义(χ2= 5.714，P=0.017)。

2.3 AFP-L3、P53抗体与HCV基因分型多因素logistic回归分析 单因素分析结果显示，HCV基因分型、AFP-L3(%)与P53抗体与HCV-HCC相关(P值均<0.05)，可纳入多因素回归模型。采用多项logistic前进回归分析：剔除引起明显多重共线性的指标，进入的P值设为0.05，排除的P值设为0.10。结果显示，AFP-L3(%)、P53抗体、HCV基因分型对HCV-HCC的影响均有统计学意义(P值均<0.05)(表2)。通过logistic前进法将HCV基因分型、AFP-L3(%)与P53抗体重新拟合并建立模型：Logit(Y)=-3.881+0.031XAFP-L3(%)+0.043XP53+1.218XHCV基因分型。Y为联检的阳性概率值。

表2 AFP-L3(%)、P53抗体、HCV基因型的多因素logistic回归分析

2.4 ROC曲线分析和诊断价值 将Y和单项指标AFP-L3(%)、P53抗体、HCV基因型进行ROC曲线分析，取Youden指数最大时对应值为Cut-off值，比较敏感度和特异度等参数。结果显示AFP-L3(%)、P53抗体和Y的Cut-off值分别为22%、18 ng/ml和0.248。AUC比较结果显示，P53抗体筛查HCV-HCC 的AUC为0.887，明显高于HCV基因型的0.758(Z=3.12,P=0.002)和 AFP-L3(%)的0.863(Z=0.78,P=0.44)；Y筛查HCV-HCC的AUC为0.945，明显高于HCV基因型的0.758(Z=6.17,P<0.001)和 AFP-L3(%)的0.863(Z=3.97,P<0.001)及P53抗体的0.887(Z=3.07,P=0.002)。单项指标之间比较结果显示，AFP-L3(%)的特异度、阳性预测值均高于P53抗体、HCV基因型；P53抗体的敏感度、阴性预测值、AUC、诊断符合率均高于AFP-L3(%)、HCV基因型。Y与单项指标比较结果显示，Y的AUC、敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及诊断符合率均高于单项中较高的检测指标，分别为0.945、90.90%、94.00%、93.80%、91.16%及92.44%(图1，表3)

3 讨论

HCC是目前我国第4位常见恶性肿瘤及第2位致死性肿瘤[12]，早期诊断HCC具有重要意义。AFP-L3和P53抗体在早期诊断HCC中具有一定价值[13]。但是在临床实际中，单项指标检测筛查HCC效果不理想，而联合检测或许是更有前景的方案。本研究采用HCV基因型、AFP-L3(%)及P53抗体联合检测筛查HCC，结果显示，AFP-L3(%)、P53抗体有助于HCV-HCC与良性肝病组的鉴别诊断。通过logistic回归分析发现，HCV基因分型对HCV-HCC的影响有统计学意义，HCV 1b基因型患HCV-HCC的风险为非1b基因型的2.381倍，这与Lee等[14]的研究结果一致。此外，研究发现AFP-L3、P53抗体和HCV基因型对HCV-HCC的影响均有统计学意义，HCV基因型的 OR值(3.381)最大，AFP-L3的 OR值(1.032)最小，即同等条件下，检测指标每增加一个单位患HCC的风险：HCV基因型(提升2.381倍)>P53抗体(提升0.344倍)>AFP-L3(提升0.032倍)，表明肝细胞癌变与HCV基因型及P53抗体密切相关，这与Busato等[15]的研究结论基本一致。本研究ROC曲线分析结果显示，P53抗体的敏感度高于AFP-L3(%)，与Hwang等[16]的研究结论一致。但P53抗体在自身免疫疾病和一些健康人群中也会被检出，存在特异度较低的缺点。在本研究中，AFP-L3(%)的特异度高于P53抗体，但敏感度较低，与Ma等[17]的研究结论一致。此外，AFP-L3(%)、P53抗体的Cut-off值分别为22%、18 ng/ml，与试剂盒推荐的阳性临界值有差异，与谢芳等[6]的报道类似，是否HCV-HCC的临界值与HCC的临界值不同，这一问题尚需进一步研究探讨。

表3 AFP-L3(%)、P53抗体、HCV基因型与Y的诊断价值比较

为提升早期诊断HCV-HCC临床应用价值，笔者考虑将P53抗体、AFP-L3与HCV 1b 基因型联合检测HCC。通过多因素logistic建立模型获得3项联检的阳性概率值(Y)，结果显示，Y的AUC、敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及诊断符合率均高于单项指标中较高的检测指标，证实了联合检测优于单项指标检测。此外，已有研究[18]表明，在HCC早期，血清学检测肿瘤相关标志物可在影像学确诊前0.5～1.5年升高。因此，在当临床上发现有HCV基因型1b型及AFP-L3(%)与P53抗体升高而影像学未见异常的患者，应定期随访复查，以达到早发现、早诊断、早治疗HCV-HCC的目的。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突，特此声明。

作者贡献声明：杨自力负责课题设计及实施，资料分析，撰写论文，质量控制；张任飞负责拟定写作思路，课题分工，修改论文；何欣、张洁负责资料收集整理，标本检测，数据录入，试剂的管理；万祎负责临床病例数据的收集。