基质金属蛋白酶2/9在慢性肝脏疾病发生发展中的作用

杨尚青， 杨东亮， 刘 嘉

华中科技大学同济医学院附属协和医院 感染性疾病科， 武汉 430022

慢性肝脏疾病(chronic liver diseases, CLD)作为全球高发病率和病死率的主要诱因之一，严重危害全人类的健康。HBV和HCV可在全球数亿人中导致慢性感染。各种原因(病毒性、酒精性和代谢性等)造成的慢性肝炎反复迁延，导致肝纤维化，并进展为肝硬化及肝细胞癌(HCC)[1]。CLD发展过程中的一个重要组织学变化是细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的降解和重塑，这是病理和生理交织的复杂过程。一方面，ECM在肝脏中过度地累积参与肝纤维化和HCC进程；另一方面，HCC形成后，ECM的降解可促进癌细胞的转移和侵袭[2-3]。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)超家族成员在ECM的重塑和降解过程中发挥重要调控作用，MMP的表达和活性失调导致的ECM变化是影响多种CLD进展的重要因素[4]。新近研究表明，MMP-2/MMP-9可通过降解多种类型的底物而发挥重要的免疫调节作用，且其表达和活性也受多种炎症及免疫分子信号通路的调控。因此，全面认识MMP-2/MMP-9在CLD发生发展中的作用机制，对于寻找新的治疗策略具有重要意义。

1 MMP家族概述

20世纪60年代， Gross和Lapiere[5]在研究蝌蚪变青蛙过程的胶原重塑作用时发现间质胶原酶，即最初的MMP-1。随后，众多研究发现极大地拓展了对于MMP结构和功能的认识。迄今为止，已发现的人类MMP家族包含24个结构和功能相关的成员，根据其结构和底物特异性分为6个亚族：胶原酶、明胶酶、间质溶解素、基质溶解素、膜型MMP(membrane-type MMP, MT-MMP)和其他酶类[6](表1)。大多数MMP为组成型表达，且在维持体内稳态时发挥重要作用，如MMP-2；某些MMP仅在特定条件下由特定的细胞或组织表达，如需要炎症信号诱导表达的MMP-9，仅在巨噬细胞和肺上皮细胞表达的MMP-12，仅在牙釉质组织表达的MMP-20[7-9]。

MMP既能降解胶原、纤连蛋白、蛋白聚糖等ECM，也可作用于非ECM底物，如细胞因子、趋化因子等，在炎症和免疫应答中发挥调控功能[10]。 MMP具有很高的酶解活性，对细胞微环境存在潜在的灾难性影响，所以通常情况下，其表达量极低且作为无活性的酶原存在于微环境中。此外，MMP的定位和活性还受到多种细胞因子(如IL、生长因素、TNFα等)的严格调控[11]。在类风湿性关节炎、神经性炎症以及多种癌症中，MMP活性的失调会造成组织稳态的严重失衡[12]。因此，MMP可在胚胎发育、细胞迁移、血管生成、损伤修复、免疫应答、炎症进程中发挥重要功能。

2 MMP-2/MMP-9

明胶酶，也称为Ⅳ型胶原酶，包括MMP-2(即明胶酶-A，72 kD)和MMP-9(即明胶酶-B，92 kD)两种，是循环中主要的MMP，能够高效降解胶原分子的退化产物明胶。MMP-2/MMP-9的结构中包含信号肽区域，能够有效介导肽链的定位；其催化结构域中含有3个连续Ⅱ型纤连蛋白样重复序列，极大地提高对明胶的亲和力[13]。除明胶之外，MMP-2/MMP-9还可降解ECM中的其他分子，如弹性蛋白、纤连蛋白和某些趋化因子等。由于MMP-2/MMP-9的生理学功能不尽相同，因此表达两种酶的细胞类型也有所差异。MMP-2可由许多类型的细胞表达，包括成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞和巨噬细胞等，MMP-9则由肺泡巨噬细胞、多形核白细胞、破骨细胞和滋养细胞产生[14-15]。

2.1 MMP-2/MMP-9表达的调控 MMP-2/MMP-9的表达受物理、化学、生物等多方面的影响。正常生理情况下，肝脏中的肝细胞、肝星状细胞等均可产生MMP-2/MMP-9，但表达水平低。在肝纤维化进程中，由于多种信号通路的异常活化，如TGF/Smad和PI3K/Akt，可致使MMP-2/MMP-9的表达水平上调[16]。随着纤维化程度的加重，肝内细胞往往呈现缺氧状态，缺氧又可导致MMP-2的表达上调[17]。此外，MMP-2/MMP-9的表达也受细胞因子和趋化因子的调控，如IL-1β、TNFα诱导MMP-2表达上调，而IL-4、IL-10、IFNβ则下调MMP-9的表达[18]。

表1 人类MMP家族的分类及其底物

2.2 MMP-2/MMP-9活性的调控 分泌型蛋白可通过信号肽和囊泡分泌至细胞外，发挥相应功能。在癌症细胞中，MMP-2/MMP-9通过定位于VAMP-4和Rab-40b相关的分泌囊泡，防止错误靶向溶酶体并驱动MMP迁移至侵袭性伪足[19]。在星胶质细胞中，MMP-2/MMP-9也存在于不同类型囊泡中。因此，细胞区室化是影响MMP-2/MMP-9活性的因素之一。

由于MMP-2/MMP-9的酶解特性，其mRNA翻译后以无活性酶原形式(pro-MMP)分泌到细胞外间隙。当酶原的前肽结构域中保守半胱氨酸残基被剪切后，催化位点曝露，酶原被激活为具有生物活性的内切酶。此过程中，MMP-2/MMP-9的分子量降低，活化的MMP-2变为64 kD，活化的MMP-9变为82 kD。根据组织类型和病理进程不同，MMP活化过程可由丝氨酸蛋白纤溶酶及某些MMP介导，也可由MMP胞内激活子弗林蛋白酶、去整合素和金属蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease，ADAM)、ADAM-TS介导[20]。在肾间质纤维化过程中，纤溶酶在调控MMP活化过程中具有重要作用[20]；在肺癌细胞中，ADAM15通过活化MEK-ERK信号途径，上调MMP-9的表达和活性[21]。

MMP-2/MMP-9的酶原也可通过形成复杂膜复合物来调控激活。其中，pro-MMP-2和pro-MMP-9体内激活机制不完全相同(图1)。MMP-2活化过程中，MT1-MMP和基质金属蛋白酶抑制剂-2(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2, TIMP-2)先将胞外环境中的pro-MMP-2招募至细胞膜，从而形成pro-MMP-2/TIMP-2/MT1-MMP膜复合物，之后pro-MMP-2以此膜复合物形式被活化为MMP-2。Toth等[22]发现MT1-MMP和TIMP-2在促使pro-MMP-9活化为MMP-9时作用相似。此外，MMP-2、MMP-13也可促进pro-MMP-9活化形成MMP-9[23]。

MMP活性也受内源性抑制剂(如α2-巨球蛋白)、TIMP、具有TIMP样结构域的小分子、膜结合抑制剂等调控。目前研究最多的MMP活性抑制剂为TIMP，包括TIMP-1～TIMP-4 4种，可通过1∶1剂量可逆的抑制MMP活性。TIMP-1和TIMP-2对明胶酶的亲和力高，可分别优先结合于MMP-9和MMP-2，从而抑制其活性。TIMP对MMP的活化具有双重性质的影响，即TIMP既可抑制MMP的活化，亦可促进MMP的活化。如一方面TIMP-2可抑制MMP-2的活性；另一方面低浓度TIMP-2亦是MMP-2活化过程中的必需分子[20]。

3 MMP-2/MMP-9参与肝脏疾病的进程

3.1 肝脏的ECM 肝脏ECM主要分布于肝包膜、中央静脉和窦周隙的皮下空间。肝脏主要胶原蛋白为Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原，中央静脉区域主要为Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原，基底膜可高度检测到Ⅳ型胶原[4]。此外，纤连蛋白和层粘连蛋白也是肝脏ECM主要组分，参与维持细胞的分化和代谢。

肝脏ECM代谢是ECM合成和MMP介导的ECM水解的动态变化过程。健康肝脏ECM代谢处于稳定平衡状态，当肝脏发生病理变化时，自稳状态被打破，导致疾病进程。此过程中，MMP及TIMP表达的改变有助于调节此种病理状态的发展。除了重塑ECM外， MMP还具有重要的生物免疫功能。MMP-2通过调节TGFβ激活过程，影响肝内血管稳态；抑制MMP-9可增强血管内皮生长因子-sdf1信号转导，保护肝脏免受缺血再灌注损伤[4]。因此，MMP-2/MMP-9在维持肝脏稳态中具有重要作用，了解其在CLD进展中的意义，有助于探索针对MMP的治疗策略。

3.2 MMP-2/MMP-9与肝纤维化 CLD发病机制涉及肝细胞的反复损伤，造成炎症、坏死、纤维化并最终导致肝硬化，其中纤维化是CLD发展的主要决定因素。在肝细胞再生期间，持续存在的炎症因子使ECM转变为活性状态，导致Ⅰ、Ⅲ型胶原过度累积，最终产生纤维化[24]。研究[25]表明，HCV感染者肝内MMP-2/MMP-9过度表达，且和患者肝纤维化程度相关；当患者肝纤维化程度加剧时，MMP-9表达呈上调趋势。在胆总管结扎诱导纤维化的大鼠模型中，MMP-2/MMP-9活性增加，并在结扎第10天达到峰值后维持高水平，此现象表明胆汁淤积引起的炎症可持续增强MMP-2/MMP-9功能[26]。Zhou等[27]研究发现，切除肝组织15～30 min后，MMP-2/MMP-9表达明显增加，且迅速达到峰值。因此，MMP-2/MMP-9表达改变是肝组织内炎性细胞因子应答的早期信号。

MMP降解微环境中ECM是肝组织修复和重塑的重要特征，因此MMP-2/MMP-9表达上调亦有助于减弱肝纤维化程度。在四氯化碳(CCl4)和胆总管结扎诱导纤维化的小鼠模型中，MMP-2-/-小鼠纤维化程度明显高于对照小鼠，提示MMP-2具有抗纤维化作用[28]。Wang等[29]在纳米颗粒治疗大鼠肝纤维化过程中，观察到肝内MMP-2表达上调。此外，CCl4诱导纤维化小鼠的MMP-9表达上调，过继转移微囊化的人间质干细胞后，小鼠肝纤维化程度减弱，且伴随MMP-9表达的进一步上调，此现象表明MMP-9表达上调可改善肝脏纤维化[30]。过继转移MMP-9-/-小鼠的Kupffer细胞能显著加剧小鼠肝纤维化程度[31]。

在肝纤维化进展过程中，MMP表达改变伴随TIMP的变化以维持体内稳态。受损的肝脏可同时呈现MMP活性和TIMP浓度上调；CCl4诱导TIMP-1转基因小鼠的肝组织纤维化程度显著高于野生对照组[26]。因此，MMP和TIMP是肝纤维化过程中的重要调控因素。为了全面分析MMP-2/MMP-9在肝纤维化中的作用，也必须明确TIMP-1和TIMP-2的变化。在肝纤维化患者中，MMP-2/TIMP-1比率反映肝细胞损伤程度[26]。调节MMP/TIMP平衡对病理性ECMP转为生理性ECM至关重要。此外，HCV感染者血清学和组织学结果显示，MMP-2和TIMP-1可作为预测肝纤维化的非侵入型参数：丙型肝炎肝硬化患者MMP-2活性上调，且TIMP-1表达在肝炎、肝纤维化和肝硬化患者中持续增加[32]。因此，定期监测肝炎患者MMP-2/MMP-9水平可作为预测肝纤维化进程的指标。

3.3 MMP-2/MMP-9与HCC HCC是肝脏中最常见的原发恶性肿瘤，随着发病率的增加，它已成为全球肿瘤相关死亡的第二大主要原因，每年导致80多万人死亡[33]。ECM与细胞间相互作用，影响癌细胞增殖、迁移、凋亡等方面。早期癌细胞表达MMP有助于ECM重塑并释放膜结合生长因子，提供肿瘤发生的微环境；随后MMP-2/MMP-9通过降解由基底膜、间质结缔组织和各种蛋白组成的ECM，调控肿瘤的进程和转移；最后MMP还影响癌细胞的存活以及凋亡[14]。因此，MMP-2/MMP-9在肝癌细胞转移、侵袭、血管生成和凋亡等进程中发挥重要调控作用(表2)。

ECM是阻碍肝癌细胞转移的重要屏障，无法控制肝癌细胞转移是HCC患者死亡的主要原因之一。MMP-2/MMP-9可降解ECM，破坏细胞外物理屏障，促进肝癌细胞转移及侵袭。其主要过程为：首先细胞内外连接断开，释放肝癌细胞；然后ECM降解，肝癌细胞发生迁移；接着肝癌细胞渗透至血液或淋巴管，黏附于内皮细胞；最后导致体内其他部位出现继发性肝癌细胞生长。近期研究[34]表明，通过调控MMP-2/MMP-9表达活化，可控制肝癌细胞的转移侵袭能力。在人肝癌细胞中，激活ERK1/2-JNK1/2信号通路显著降低MMP-2/MMP-9表达；而特异性抑制ERK1/2-JNK1/2可恢复Huh-7细胞的MMP-2/MMP-9表达，促进肝癌细胞侵袭能力[35]。

ECM降解既促进肝癌细胞转移和侵袭，还提供原发性肿瘤生长的必要空间。由于基底膜破坏，内皮细胞迁移至新生血管，释放ECM结合因子，血管中氧气及营养物质的供应也对肝癌细胞生长至关重要。研究表明MMP-2/MMP-9调控肝脏肿瘤内新生血管生成。Yoshiji等[36]发现，小鼠肝癌组织MMP-2/MMP-9活性上调，通过介导血管内皮生长因子和血管生成素2的协同作用调控肿瘤血管生成和HCC发展。在人肝癌细胞HepG2和Hep3B中，过氧化物酶体增殖剂激活受体γ通过抑制下游septin-2蛋白功能，下调MMP-2/MMP-9表达，抑制血管生成和肝癌细胞生长[37]。此外，MMP-9还可影响肝癌细胞存活和凋亡。MMP通过剪切黏附分子，调控血管抑制素、内皮抑制素分泌等方式促进肿瘤细胞凋亡[38]。Li等[39]发现，高表达MMP-9和低表达microRNA-328-3p的肝癌细胞凋亡率高、增殖能力低，此类肝癌患者病理分期低且总体生存率高。

MMP-2/MMP-9表达还与HCC不良预后相关。HCC患者肿瘤组织高表达促进肿瘤转移和侵袭的胸苷磷酸化酶，其和MMP-2/MMP-9表达显著正相关，且和恶性肝癌患者不良预后负相关[40]。通过降低肝癌细胞MMP-2/MMP-9表达，能有效抑制肝癌细胞侵袭相关的β-catenin信号通路活化[41]。Daniele等发现HCC患者中MMP-2和TIMP-2表达均显著高于健康对照；经肝动脉化疗栓塞术治疗后，其血清TIMP-2逐渐升高，MMP-2/TIMP-2比率降低，患者存活率增高[42]。因此，MMP-2/MMP-9表达和活化可作为判断HCC转移和预后的重要指标。

3.4 MMP-2/MMP-9与肝脏免疫 MMP-2/MMP-9参与多种免疫进程，发挥重要作用。MMP-2是经典趋化因子活性调节分子，可裂解单核细胞趋化蛋白的N端，导致CCL2、CCL4、CCL7、CCL8、CCL11、CCL13、CCL15和CXCL12等因子失活，发挥抗炎作用；另一方面，MMP-2也诱导具有巨噬细胞趋化作用的CCL16和CCL23活化[43]。此外，MMP-2可降解补体C1抑制剂，从而维持补体功能。MMP-2表达缺陷可致基因敲除动物补体活化功能严重受损[44]。

笔者新近研究发现，MMP-2/MMP-9在肝内病毒特异性CD8+T细胞应答的发生中也发挥重要调控作用。笔者的研究显示，MMP-2/MMP-9联合作用可诱导T淋巴细胞膜表面CD100分子裂解释放至外周血，形成可溶性CD100(sCD100)。sCD100通过与其受体CD72结合，诱导肝内抗原提呈细胞活化从而增强抗病毒CD8+T细胞应答。在慢性HBV感染过程中，患者外周血MMP-2表达水平显著下降，从而造成其血清sCD100水平低下，无法诱导有效的肝内HBV特异性CD8+T细胞应答，导致病毒感染持续[45]。

4 总结

从MMP发现至今，对其家族不断深入的研究表明：MMP不仅是能够降解多种蛋白质和分子的酶，还具有复杂的免疫调节作用。其中，MMP-2/MMP-9在多种CLD进程中发挥重要作用，这与疾病发展过程中多种信号通路，特别是炎症及免疫分子信号通路密切相关。因此，全面研究MMP-2/MMP-9生物免疫学效应，对于深入阐明相关肝脏疾病进展过程具有重要意义，并为探索新的治疗方法和策略奠定基础。

作者贡献声明：杨尚青负责综述立题，撰写论文；杨东亮参与指导修改论文；刘嘉负责拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。

表2 MMP-2/MMP-9对HCC的影响