紫皮豇豆总多酚提取工艺研究及组分分析

吴琼 王明月 葛会林 马晨 吕岱竹

摘要：[目的]采用溶劑萃取法提取紫皮豇豆中的总多酚，多酚提取物经大孔树脂分离纯化，再利用高效液相色谱（HPLC）分析其多酚类化合物的组成及含量，为紫皮豇豆中多酚类物质的提取、分析提供理论依据。[方法]以总多酚提取量为考察指标，采用单因素和正交试验，分析提取溶剂、料液比、温度和pH对紫皮豇豆总多酚提取量的影响，再通过SephadexLH-20大孔树脂对粗提物进行分离纯化，并建立紫皮豇豆中6种多酚类组分的HPLC分析方法，采用外标法定量。[结果]紫皮豇豆中总多酚的最佳提取工艺为：经料液比1：5（m：V）的80%丙酮水溶液，在4C、pH6条件下，提取3次，每次提取5h时，所得的总酚含量最高为614mg（GAE）.100g。在优化的试验条件下，没食子酸、没食子儿茶素、绿原酸、芦丁、p-香豆酸和阿魏酸等6种多酚单体在相应的浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数（r）为0.9959～0.999，方法检出限和定量限分别为0.1～1mg：100g和0.2～2.5mg：100g;加标试验平均回收率74.3～107%，相对标准偏差0.4～8.6%。经HPLC分析，紫皮豇豆中6种多酚单体均有检出，含量在0.46～6.5mg：100g"，其中含量最高的是芦丁。[结论]采用80%丙酮水溶液提取紫皮豇豆总多酚，并利用HPLC法测定紫皮豇豆中几种单体酚的方法提取率高、准确性好，适用于紫皮豇豆中多酚类化合物的提取及定性定量分析。

关键词：紫皮豇豆;多酚;提取纯化;成分分析

中图分类号：TS201.4

文献标志码：A

文章编号：1008-0384（2020）060673-09

0引言

[研究意义]海南产紫皮豇豆（PurpuraRubrumVignaUnguiculataSubsp.Cylindrica）为短荚豇豆，豆荚长约25～30cm，耐热适合夏季种植。紫皮豇豆中除含有易于消化吸收的优质蛋白质、丰富的脂肪膳食纤维等营养物质外叫，还含有丰富的多酚类化合物引，有健脾补肾、消脂降糖及促进胃肠道蠕动等功效，是一种优质的稀有蔬菜，具有较高的保健价值。尽管多酚广泛存在于蔬菜、水果及茶叶等植物源性食物中，但是它在不同食物中的含量和结构有很大差异+-5，且相较于一般蔬菜，普遍认为深色蔬菜中的多酚类物质含量更高”一切。多酚（Plantpolyphenol）也称植物单宁，是一类从植物源性食物中发现的，具有保健作用的物质，由多种环状酚类化合物聚合而成，也被称为“第七类营养素”按分子量和结构的不同主要分为两大类，即多酚单体和由单体聚合而成的低聚或多聚体的单宁类物质。其中，多酚单体因具有抗氧化、清除亚硝酸盐、调节肥胖、预防癌症、心脏病等功效，近年来成为众多学者广为研究的对象0-。[前人研究进展]随着科学技术的迅速发展，植物源性食物中多酚物质的提取方法得到不断优化，其中，常用的是溶剂萃取法。陆广念等2研究发现，长绿豇豆经75%乙醇超声提取得到的总多酚含量为74.071mg100g，总多酚的含量在10种蔬菜中仅次于藕、大蒜和菠菜;林宝妹等！3优化了嘉宝果叶片总多酚的提取工艺，采用优化后的工艺提取嘉宝果叶片总多酚含量可达33.84%，比已报道的方法提取的嘉宝果叶片总多酚含量高23.63%;张东峰等叫采用80%甲醇溶液提取柑橘果皮及果肉中的多酚，并对比了其中不同柑橘品种的总多酚含量，其中柑橘果皮的多酚含量（GAE）为2477～4748mg100g，其中以塔罗科血橙皮中多酚含量最多。本课题组前期通过浸提的方法获取多酚、花色苷和磷脂，发现紫皮豇豆中的多酚类物质体外降糖效果较好，总多酚含量与a-葡萄糖苷酶抑制活性存在显著正相关性，提高提取物中总多酚含量可增强对a-葡萄糖苷酶的抑制活性以。[本研究切入点]已有文献报道了长绿豇豆多酚的总含量，但对于紫皮豇豆中多酚类物质的提取工艺及组成分析尚未见报道。[拟解决的关键问题]为高效获取紫皮豇豆多酚，本文采用单因素试验和正交试验设计通过溶剂提取的方法研究紫皮豇豆总多酚的提取工艺，建立测定紫皮豇豆中6种多酚单体的HPLC检测方法，旨在为紫皮豇豆多酚类物质的提取、分析及新品种的选育与开发利用提供理论参考。

1材料与方法

1.1仪器、材料与试剂

1.1.1仪器设备sYNERGY2多功能微孔板检测仪;晶安石英96孔酶标板;高效液相色谱仪配有紫外检测器（Waterse2695）;色谱柱（WatersPAHC185um，4.6X250mmColumn）;玻璃层析柱（5X25cm）;微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）;高速冷冻离心机（HITACHICR22N）;冷冻千燥机（北京四环科学仪器有限公司）;AL204电子天平（感量0.0001g，瑞士Metler-Toledo公司）;SynergyUV超纯水制备系统（美国Millipore公司）;移液枪以及其他实验室常用仪器设备。

1.1.2试验材料紫皮豇豆采自海口，市售新鲜，品种为“八月豆”。

1.1.3试验试剂标准品没食子酸（Gallicacid）、没食子儿茶素（GC）、绿原酸（Chlorogenicacid）、芦丁（Rutin）、p-香豆酸（p-Coumalicacid）和阿魏酸（Ferulicacid）标准品（纯度》98.0%，购自源叶生物科技有限公司）;丙酮、甲醇和乙醇均为色谱纯（美国ThermoFisherScientific公司）;SephadexLH-20（羟丙基葡聚糖凝胶）填料（美国GE公司）;试验用水为MilliporeDirect-Q5超纯水仪制备，甲酸等其它试剂为国产分析纯。

1.2高效液相色谱条件

WatersPAHC18色谱柱（5um，4.6mmX250mm），柱温：30C;流速1.00mL;min';进样量：10p山;流动相A为0.2%（VV）甲酸水溶液，流动相B为乙腈;梯度洗脱程序：0～1min，10%A;1～4min，10%～25%A;4～1lmin75%～90%A;l1～15min，10%A;检测波长：0～5.8min，278m;5.8～15min，327m。

2.1.2温度对总多酚提取率的影响以80%的丙酮溶液为提取溶液，考察温度对总多酚提取率的影响。由图2可以看出，提取温度为4C时紫皮豇豆总多酚的提取率最高为74.5%，随着温度提高提取率变化不大。考虑试验的实际操作，选取4C作为最佳的提取温度。

2.1.3料液比对总多酚提取率的影响以80%的丙酮溶液为提取溶液，考察料液比对总多酚提取率的影响。由图3可以看出，紫皮豇豆总多酚的提取率随着料液比的增加而升高。当料液比为1g：5mL时，总多酚的提取率最大为78.1%，继续增加提取溶剂量提取率变化不大，当料液比达到1g：10mL时出现总多酚提取率下降的趋势。考虑环境友好及试验的经济性，选取1g：5mL作为最佳的料液比。2.1.4pH对总多酚提取率的影响多酚类物质大部分呈弱酸性，因此，试验选择偏酸性条件考察pH对总多酚提取率的影响。从图4可以看出，pH对紫皮豇豆总多酚的提取具有显著的影响，pH=6时提取效果最好为78.6%。

2.2正交试验结果与分析

2.2.1正交试验结果由表3可知，通过极差分析得出影响紫皮豇豆总多酚提取量4个因素的主次关系为：A（提取溶剂）》D（pH）》C（温度）》B（料液比），提取溶剂对反应的影响最大，对于收率指标的最佳工艺组合为ABjC，D，但因素C中水平2和3相差不大，本着节省成本、减少溶剂用量、降低环境污染的原则，本试验选择水平2作为提取条件。即最佳工艺组合为AjB，C，D，提取溶剂为80%丙酮，提取温度为4C，料液比m栏品（g）：V溶训（mL）=1：5，pH为6为最优提取条件。采用优化后的方法得到紫皮豇豆中的总多酚提取液，在45C下于旋转蒸发仪中除去两酮，剩余溶液经过冷冻千燥得到多酚提取物2.32g。

2.2.2正交试验结果验证按照最佳的反应条件做3次重复试验，紫皮豇豆提取物中总多酚含量平均值为614mg（GAE）100g，高于表2中任何组合，相对标准偏差为0.6%，试验结果的重复性很好，说明该试验条件选取得当。

2.3检测方法评价

2.3.1流动相的选择采用0.2%（V/V）甲酸水溶液一乙腈为流动相，没食子儿茶素等儿茶素类化合物、芦丁等黄酮类化合物和没食子酸、阿魏酸、绿原酸和p-香豆酸等酚酸类化合物各组分有良好的峰形且相较于不加甲酸的流动相有更好的响应值，对比图见图5。紫皮豇豆中的黄酮类和酚酸类多酚物质的共同特征是具有羟基或同时含有羟基与羧基等官能团，表现出一定的弱酸性，甲酸的加入有利于抑制多酚类化合物与色谱柱的静电作用，减少拖尾，改善峰形。因此，试验中选用0.2%（V/V）甲酸水溶液-乙腈为流动相，梯度洗脱。

2.3.2波长的选择试验发现没食子酸和没食子儿茶素的紫外吸收波长在270nm～280nm，绿原酸、芦丁、p-香豆酸和阿魏酸的紫外吸收波长在300nm～350nm，各个成分吸收效果最好。本试验选用分段扫描的方式，所选取的液相色谱柱可保证没食子酸和没食子儿茶素在5.110min前有保留，在5.8min将扫描波长由278nm切换到327nm，所有多酚类化合物均呈现良好的响应值。

2.3.3方法评价结果显示，在相应的浓度范围内，以标准溶液浓度（yg*mL）为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线呈良好的线性关系，相关系数r为0.9959～0.9999（表4）。确定方法的检出限为0.1～1mg：100g和定量限为0.2～2.5mg·100g，能满足定量分析的要求。样品加标回收试验平均回收率74.3%～107%，相对标准偏差0.4%～8.6%，结果见表5。纯化后紫皮豇豆多酚组成成分的HPLC色谱图见图6-b，图6-a为同等色谱条件下6种多酚标准混合溶液的HPLC色谱图。

2.4紫皮豇豆样品的测定

收集10份海南产八月豆紫皮豇豆样品，按照2.2.1正交试验优化得到的提取方法及1.4.5纯化方法得样品待测溶液，按1.2色谱条件进行检测分析，具体结果见表6。每个样品重复测定3次，在所采集的样品中6种多酚组分均有检出，平均含量为0.462～6.479mg：100g。结果表明，在紫皮豇豆中6种多酚单组分平均含量最高的是芦丁，其次是p-香豆酸，含量最低的是没食子酸。

3讨论与结论

本研究利用有机溶剂提取法，以八月豆为原材料，对紫皮豇豆多酚提取工艺进行研究。以单因素实验结果来看，提取溶剂、温度、pH和液料比等因素对多酚提取效果均有一定的影响，其中，提取溶剂对提取效果的影响最大。水是植物多酚的良好溶剂，但是提取中多酚往往与蛋白质、多糖相结合，需要断裂氢键，经试验论证丙酮和水的复合体最适合紫皮豇豆中多酚的提取。从正交试验结果来看，最佳，工艺条件：提取溶剂为80%丙酮，提取温度为4C，料液比m样品（e）：V提取溶剂（mL）=l：5，pH为6为最优，用最優工艺条件测得紫皮豇豆中总多酚的含量为614mgGAE·100g。

虽然多酚提取方法的研究较多，但针对紫皮豇豆尤其是海南产八月豆中多酚的研究甚少，陆广念等叫报道的采用75%乙醇提取的长绿豇豆总多酚含量为74.071mg：100g，低于本试验从紫皮豇豆中提取得到的总多酚含量。分析原因可能是紫皮豇豆中除含有酯化、糖苷化的多酚类大分子化合物以及单宁类物质外叫，还含有大量的花青素等类黄酮色素类物质。此类物质在利用大孔树脂吸附法对多酚粗提物进行分离纯化时，保留在层析柱中未被洗脱出来，而低分子量多酚类化合物则是利用乙醇洗脱得到。除去溶剂后再利用HPLC对纯化后的多酚类物质进行组分分析，通过对色谱条件的优化，建立了PLC法同时测定紫皮豇豆中没食子儿茶素、绿原酸、芦丁、没食子酸、p-香豆酸和阿魏酸等儿茶素类、黄酮类及酚酸类多酚化合物的检测方法，紫皮豇豆中6种多酚单体含量最高的是芦丁为6.479±0.130mg：100g。以上研究结果表明：多酚虽然广泛存在于植物体内，但由于植物成分的复杂性，在不同种类和品种中的含量差异较大，必须对其提取工艺进行摸索和优化，并进行综合评价，才能够得到比较科学、合理的数据。

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（责任编辑：吴宇琳）

吴琼，王明月，葛会林，等.紫皮豇豆总多酚提取工艺研究及组分分析[J].福建农业学报，2020，35（6）：673-681.