狼毒素对常见植物病原菌的活性测定

李增强

（甘肃省兰州市西固区元峁山林场，甘肃兰州730060）

化学农药的使用为农业生产提供了有力的支持，但是化学农药的大量不合理使用带来的农药残留和环境污染等问题，直接危害到人畜健康，影响到农业的可持续发展，且耗费巨大的人力、物力。因此，高效、环保、无害的生物农药研发越来越显示其重要的社会意义和经济价值，已经成为现代农药研发的发展方向。目前，生物农药，尤其是植物源农药的研究和开发逐步成为热点。

狼毒素由甘肃国力生物科技开发有限公司从瑞香狼毒根中提取而来，是一种新型的植物源农药。据文献报道，瑞香狼毒提取物具有杀菌、杀线虫活性[1-4]。黄瓜枯萎病菌（FusariumOxysporium）、马铃薯丝核病菌(Rhizoctonia solani)、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、番茄早疫病病菌（Alternaria solani）、茄子菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小麦长蠕孢菌(Helminthosporiumsativum)、棉花炭疽病菌(Gromerella gossypii)、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、大麦赤霉菌(Fusarium graminearum)、西瓜蔓枯病菌(Didymella bryoniae)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、枸杞炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）是我国蔬菜和粮食作物上常见的植物病原菌，一直以来影响农作物的产量和品质，其危害程度不容小觑，但是在农业生产中防治植物病原菌仍主要依赖于化学杀菌剂[5-7]。现以上述几种植物病原菌为供试生物材料，评价甘肃国力生物科技开发有限公司生产的狼毒素原液和制剂对常见植物病原真菌的活性，明确其抑菌活性和制剂化对其活性的影响，为该产品的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌种 黄瓜枯萎病菌、马铃薯丝核病菌、番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌、茄子菌核病菌、小麦长蠕孢菌、棉花炭疽病菌、油菜菌核病菌、大麦赤霉菌、西瓜蔓枯病菌、棉花枯萎病菌、枸杞炭疽病菌。

1.1.2 供试药剂 1.6%狼毒素水乳剂、9.8%狼毒素原药，均由甘肃国力生物科技开发有限公司生产。

1.1.3 试验仪器 SPX智能生化培养箱、KQ2200E型超声波清洗机、移液枪、培养皿、打孔器、超净工作台、三角瓶、烧杯、玻璃棒等。

1.2 试验方法

1.2.1 含药培养基的制备 在无菌条件下，将狼毒素与灭菌的PDA培养基混合，每种药剂均配成1 mg/ml的浓度，最终浓度狼毒素水乳剂为160ug/ml、80 ug/ml、40 ug/ml、20 ug/ml、10 ug/ml，狼毒素原药为980ug/ml、490ug/ml、245ug/ml、122.5ug/ml、61.25ug/ml，并作空白对照，每个处理重复3次。

1.2.2 培养及接种方法 待菌培养好后在无菌条件下，用直径为5mm的灭菌打孔器打取菌饼，将打好的菌饼用无菌接菌针挑起迅速接入含毒PDA平板的中央，盖上培养皿盖，放置24～26℃下培养，各浓度条件下抑菌活性成分对菌落生长的抑制作用是用生长速率法进行测定，并用SPSS17.0进行数据处理。

1.2.3 生物测定方法 参考生长速率法[3，4]，在常温、无菌条件下，取1 ml提取液至25 ml刻度试管，对照组加入等量对应溶解溶剂，再倒入融化的PDA培养基至10 ml，充分混匀后在50～55℃时，倒入90 mm培养皿中制成平板，平板凝固后接入生长一致的菌饼(Φ=0.5 cm)。每皿接1个菌饼，每处理重复3次，25～27℃培养并观察结果。用十字交叉法测量供试真菌菌落生长直径，用下述公式计算抑制率：

菌落直径（mm）=测量菌落直径平均值Q 5

2 结果与分析

2.1 2种药剂的抑菌效果

从表1可以看出，狼毒素水乳剂除对枸杞炭疽病和小麦长蠕孢的抑菌率较低外，对其他10种植物病原菌均有较好的抑制作用。在浓度为160 ug/ml时，对番茄早疫、马铃薯丝核、茄子菌核、棉花炭疽、大麦赤霉、西瓜蔓枯、油菜菌核的抑菌率较大，均在55%以上；在浓度为80 ug/ml时，对番茄早疫、马铃薯丝核、棉花炭疽、大麦赤霉、西瓜蔓枯、油菜菌核亦有较大的抑制作用，抑菌率均在50%左右；当狼毒素水乳剂浓度低于40 ug/ml时，除了对大麦赤霉、西瓜蔓枯、棉花炭疽、番茄灰霉有较大的抑菌率外（抑菌率15%～50%），对其他植物病原菌的抑制作用相对较差（抑菌率低于15%）。

表1 狼毒素水乳剂对12种病原真菌的抑菌率（5 d）

从表2可以看出，狼毒素原药除对小麦长蠕孢的抑制作用不明显，对其他11种植物病原菌均有良好的抑制效果。在浓度为980 ug/ml时，对12种植物病原菌的抑制作用最显著，特别是对马铃薯丝核、西瓜蔓枯、枸杞炭疽、油菜菌核的抑制作用最明显，抑菌率均在70%以上；浓度为490 ug/ml时，抑菌率明显下降，只有对西瓜蔓枯和油菜菌核的抑菌率在65%以上；当浓度低于245 ug/ml时，狼毒素原药对番茄早疫、马铃薯丝核、棉花炭疽、大麦赤霉、西瓜蔓枯、油菜菌核表现出明显的抑制作用，抑菌率45%～50%，而对其他植物病原菌的抑制作用不明显，抑菌率1%～44%。

2.2 2种药剂的显著性差异分析

从表1和表2可以看出，狼毒素水乳剂在160 ug/ml浓度下，番茄早疫、马铃薯丝核、茄子菌核、大麦赤霉、西瓜蔓枯、油菜菌核最为敏感；在80 ug/ml浓度下，马铃薯丝核、西瓜蔓枯、油菜菌核最为敏感；在40 ug/ml浓度下，对番茄灰霉、马铃薯丝核、棉花炭疽、大麦赤霉、西瓜蔓枯、油菜菌核作用最为明显；在20 ug/ml和10 ug/ml浓度下，均对西瓜蔓枯作用最为显著。

狼毒素原药在980 ug/ml和490 ug/ml浓度下，均对西瓜蔓枯和油菜菌核的抑菌作用最显著；在245 ug/ml浓度下，对番茄早疫、马铃薯丝核、棉花炭疽、大麦赤霉、西瓜蔓枯、油菜菌核抑菌作用最为显著；在122.5 ug/ml浓度下，对番茄早疫、棉花炭疽、大麦赤霉、油菜菌核的抑制作用最为显著；在61.25 ug/ml浓度下，番茄早疫和油菜菌核表现最敏感。油菜菌核在各个浓度下均表现出对狼毒素原药的敏感性。

表2 狼毒素原药对12种病原真菌的抑菌率（5 d）

表3 狼毒素水乳剂对12种病原真菌的毒力测定结果（5 d）

表4 狼毒素原药对12种病原真菌的毒力测定结果（5 d）

2.3 2种药剂对12种植物病原菌的毒力测定

从表3可以看出，狼毒素水乳剂对12种植物病原菌的EC50由小到大的顺序为西瓜蔓枯58.4252ug/ml、油菜菌核72.001 4 ug/ml、大麦赤霉77.982 4 ug/ml、马铃薯丝核81.462 6 ug/ml、棉花炭疽95.357 ug/ml、番茄早疫 98.0565ug/ml、茄子菌核99.3082ug/ml、番茄灰霉 182.7267ug/ml、棉花枯萎 237.1037ug/ml、黄瓜枯萎239.788 6 ug/ml、小麦长蠕孢635.509 1 ug/ml、枸杞炭疽1 413.07 ug/ml。狼毒素水乳剂抑制一半的西瓜蔓枯、油菜菌核、大麦赤霉、马铃薯丝核、棉花炭疽、番茄早疫和茄子菌核等菌丝生长所需浓度最低，EC50均在100 ug/ml以下，表现出较强的抑菌活性。

从表4可以看出，狼毒素原药对12种植物病原菌的EC50由小到大的顺序为油菜菌核144.4695ug/ml、西瓜蔓枯278.7175ug/ml、大麦赤霉279.6489ug/ml、番茄早疫291.1714ug/ml、马铃薯丝核311.0716ug/ml、棉花炭疽352.1423ug/ml、棉花枯萎460.5456 ug/ml、枸杞炭疽461.9345ug/ml、茄子菌核491.2509ug/ml、番茄灰霉526.5388ug/ml、黄瓜枯萎588.0612ug/ml、小麦长蠕孢1 505.391 ug/ml。狼毒素原药抑制一半的油菜菌核、西瓜蔓枯、大麦赤霉、番茄早疫、马铃薯丝核、棉花炭疽、棉花枯萎、枸杞炭疽和茄子菌核的菌丝生长的浓度最低，均在500 ug/ml以下，对这9种植物病原菌表现出较强的杀菌活性。

从总体上看，狼毒素原药对病原菌的EC50要比狼毒素水乳剂的高，其中只有狼毒素原药对枸杞炭疽的EC50比狼毒素水乳剂的低；狼毒素水乳剂的抑菌效果比狼毒素原药好。2种药剂均对西瓜蔓枯、油菜菌核、大麦赤霉、马铃薯丝核、棉花炭疽、番茄早疫和茄子菌核等7种病原菌表现出较强的抑菌活性，而对其他病菌的抑菌活性较弱。

3 小结与讨论

除了狼毒素原药对小麦长蠕孢抑菌作用不明显，狼毒素水乳剂对枸杞炭疽病和小麦长蠕孢抑菌效果不佳外，狼毒素原药和水乳剂对上述10种植物病原菌均有良好的抑制效果，其中狼毒素原药的抑菌率整体上大于狼毒素水乳剂，但EC50原药大于水乳剂，因此狼毒素水乳剂对12种供试菌种的抑菌效果比狼毒素原药好。可以看出，未来狼毒素具有广阔的应用前景，只是狼毒素原药溶解性方面有待改进，狼毒素水乳剂有较好的抑菌效果，狼毒素水乳剂只在室内进行了毒力测定，要让狼毒素真正投入农业生产中还需进行进一步的田间试验。