枸橘药材HPLC特征指纹图谱研究

付 妍，张亚双，王亚琼，张华锋，陈 卫，周 坚，邢以文，薛 满

(苏州市药品检验检测研究中心，苏州 215014)

枸橘为芸香科(Rutaceae)植物枸橘PoncirustrifoliataL. Rafin.的近成熟果实，被《江苏省中药材标准(2016年版)》收载。有关研究表明[1-3]，枸橘中含有黄酮类、挥发油类、香豆素类、生物碱类、有机酸类、萜类等化学成分。现代药理学研究表明[4-13]，枸橘具有抗肿瘤、抗过敏、抗病毒、调节胃肠道运动等作用。经对本草考证，枸橘又名绿衣枳实。有文献报道测定枸橘中柚皮苷的含量[14]，但若只测定其中一个组分的含量显然不能全面有效地控制枸橘的质量。目前，特征指纹图谱是控制中药质量的有效方法之一。通过文献检索和研究发现，采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)的梯度洗脱程序能较好地分离枸橘中各组分，较全面地反映枸橘组成的整体信息，故选择HPLC作为枸橘特征指纹图谱的测定方法。

1 仪器与试药

Waters高效液相色谱仪[沃特世科技(上海)有限公司，包括Waters-2489四元泵、Waters-2998二极管阵列检测器、Empor化学工作站]；KQ-250B型超声清洗机(昆山超声电子设备厂)。

甲醇为色谱纯；水为重蒸馏水；冰醋酸为分析纯；对照品柚皮苷(批号：110722-201111，纯度：93.2%)和欧前胡素(批号：110722-201111，纯度：99.6%)购于中国食品药品检定研究院；15批枸橘药材由苏州市天灵中药饮片有限公司等6家企业提供，经苏州市药品检验检测研究中心中药室张华锋主任鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取柚皮苷对照品、欧前胡素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml各含柚皮苷150 μg、欧前胡素60 μg的溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备

取枸橘药材粉末(过四号筛，批号：151219)，约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 50 ml，称定重量，超声处理(功率250 W，频率50 kHz) 30 min，放冷，再称定重量，加甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件

Diamonsil Plus C18-A色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)，以甲醇(A)-1%冰醋酸溶液(B)为流动相，按表1中的规定进行梯度洗脱，检测波长283 nm，柱温30 ℃。

表1 梯度洗脱表

2.4 色谱峰的确认

分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μl，注入HPLC仪。供试品HPLC见图1，图中呈现6个特征峰，与参照物柚皮苷峰相对应的峰为峰2，计算各特征峰与峰2的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%之内，其规定值为：0.97(峰1)、1.00(峰2)、1.22(峰3)、1.24(峰4)、1.62(峰5)、2.04(峰6)。

峰2(S)：柚皮苷;峰5：欧前胡素图1 枸橘药材的HPLC图

2.5 方法学验证

2.5.1精密度试验

取同一样品，按“2.2”项下方法制备成供试液，进样10 μl分析，一共进样6次，考察各色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果：各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于2.0%，说明该仪器的精密度良好。

2.5.2重复性试验

取同一批号样品(批号：15041403)共6份，按“2.2”项下方法制备成供试液，进样10 μl，考察各色谱峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果：各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于4.0%，说明该方法的重复性良好。

2.5.3稳定性试验

取同一批号样品(批号：15041403)，按“2.2”项下方法制备成供试液，分别于0、2、4、8和12 h进样一次，共测定12 h，分别进样10 μl，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性。结果：各特征峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均小于3.0%，说明样品供试液在12 h内稳定性良好。

2.5.4不同柱温考察

采用Diamonsil Plus C18-A色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，分别考察了28、30和35 ℃。结果：不同柱温对其分离度基本上没有影响，考虑到色谱柱的耐受性以及分析时间的长短，故确定色谱柱的温度为30 ℃。

2.5.5不同色谱柱考察

取同一批号样品(批号：15041403)，按“2.2”项下方法制备成供试液，采用Waters Symmetry Shield RP18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Diamonsil Plus C18-A色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Boston Green ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)进行测定。结果：Diamonsil Plus C18-A色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)检出的色谱峰较多，且分离度良好，故选择此色谱柱进行实验。

2.6 特征指纹图谱的建立

取15批枸橘药材粉末，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下方法检测。将检测结果导入软件《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2004A版，15批枸橘药材HPLC指纹图谱见图2，相对保留时间结果见表2。

图2 15批枸橘药材的HPLC特征指纹图谱

表2 15批样品的相对保留时间min

3 讨论

目前市场上枸橘药材的质量良莠不齐，建立一个可靠的质量标准势在必行。本研究建立的方法可以和枸橘药材的含量测定一起作为控制枸橘药材质量的标准，可以有效地监控枸橘药材的组成与质量恒定性，为市场监管提供有效的技术支撑。

采用二极管阵列检测器检测，以峰数和分离度为指标，将样品在200～400 nm进行扫描，分别考察了220、240、283、300和360 nm波长下的色谱峰，结果283 nm下的色谱峰分离较好，考虑到柚皮苷作为参考峰，且柚皮苷的最大吸收波长也在283 nm，因此最终确定283 nm作为检测波长。

实验中采用不同的提取溶剂，样品的色谱峰基本一致，结合《江苏省中药材标准》2016年版枸橘项下，确定甲醇作为提取溶剂。样品超声处理不同时间，其HPLC图基本一致，为提取完全，确定提取时间为30 min。