青蒿琥酯对阿霉素致大鼠肾损伤的保护作用

陶 磊，李婷婷，马旖旎，陈仁兵，李雪芹，王金娜

(山东省医学科学院附属医院，山东第一医科大学，济南 250031)

急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)是临床最常见的急危重症之一，其发病率约为30%，并且与患者的预后不良有关，主要表现为突然丧失肾排泄功能，肾功能急性恶化[1]。全球每年约有400万例死于AKI，且发病率和死亡率不断攀升，造成严重的健康和经济问题[2]。目前认为AKI是由于肾素血管紧张素系抑制剂和非甾体抗炎药对肾进、出小动脉的收缩作用的干扰而导致的，而在加强利尿的情况下极易发生脱水，导致血流动力学改变，AKI情况进一步恶化[3]。临床上对于AKI提倡早发现、早治疗，研究报道，对AKI进行早期干预可以改善其预后，并降低肾功能进一步恶化的风险[4-5]。国内外对AKI的干预研究还处于探索阶段[6]，因此，找到新的治疗靶点显得尤为重要。氧化应激被认为是细胞病理损伤的关键致病因素，其导致的病理损伤贯穿于多种肾病发生、发展的过程中。体内氧化物质增多、抗氧化物质减少加重了肾细胞内的炎症反应，最终成为了肾病的发展及恶化的重要原因之一[7]。青蒿素的半合成衍生物青蒿琥酯(artesunate, ART) 是治疗疟疾的标准药物, 而且还具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节及抗氧化应激的作用[8]。本研究中采用阿霉素(adriamycin，ADR) 诱导大鼠肾损伤，观察青蒿琥酯对阿霉素肾病大鼠肾损伤的治疗作用，并探讨其可能的作用机制，为临床治疗提供合理用药依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

6～8周龄SPF级雄性Wistar大鼠32只，体重220～250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK (京) 2016-0006]。Wistar大鼠饲养于河北医科大学第四医院实验动物中心[SYXK (冀) 2018-001]，屏障环境温度18℃～24℃，湿度40%～60%，饲料、饮水均经过高压灭菌处理。所有动物实验通过河北医科大学第四医院实验动物伦理审查(IACUC-4thHos Hebum- 201968)，并依据优化、减少、替代的 3R 原则进行实验设计。

1.2 主要试剂与仪器

青蒿琥酯(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号: H32020967)；盐酸阿霉素(美国Med Chem Express公司)；组织超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(Maleicdialdehyde， MDA)以及谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)测定试剂盒购自于南京建成生物工程研究所；10%多聚甲醛溶液(北京索莱宝科技有限公司)。

全自动生化分析仪LX20PRO(美国Beckman Coulter公司)；Synergy HT 型多功能微孔板检测仪(美国 Biotek公司)；防脱载玻片(北京索莱宝科技有限公司)；Tissue-Tek TEC 全自动组织石蜡包埋机(日本樱花公司)；IVS-410 自动石蜡切片机(日本大和光机工业株式社)；CS-V1型摊片烤片机(孝感宏业医用仪器有限公司)；303-4A数显电热保温箱(上海阳光实验仪器有限公司)；BX41光学显微镜(日本OLYMPUS公司)；Qcapture图像采集系统(加拿大QIMAGING公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 阿霉素肾病模型的制备及分组

全部大鼠适应性饲养1周后，随机分为四组：空白对照组(NC组)、阿霉素模型组(ADR组)、青蒿琥酯低剂量组(ART-L)和ART高剂量组(ART-H)，每组8只。ADR 组、ART-L组和ART-H组均经大鼠尾静脉注射阿霉素(7.5 mg/kg)[9]。造模第2天， ART-L组和ART-H分别给予25 mg/kg 和50 mg/kg的ART灌胃，连续灌胃3周，NC组给予等体积的生理盐水。

1.3.2 一般情况

观察内容包括各组大鼠的饮食、饮水、体重、毛色、大小便、水肿、精神状况，以及死亡情况。

1.3.3 大鼠尿蛋白、血清生化指标的测定

分别于ART给药1 周、2周、3周后，收集各组大鼠24 h 尿液，检测尿总蛋白(UTP)；ART末次给药24 h后，大鼠麻醉后，采用真空促凝采血管经腹主动脉采血3～5 mL，静置后 3 000 r/min 离心 10 min，分离上层血清，全自动生化分析仪检测血清中白蛋白(ALB)、胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)和肾功能指标血尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)的含量。

1.3.4 肾组织病理学分析

大鼠肾组织经4%多聚甲醛固定，经脱水、组织包埋后制成4 μm 厚石蜡切片，行HE染色，光镜下观察肾组织病理改变。

1.3.5 肾组织 SOD、GSH-Px 活力、MDA含量的测定

取部分肾组织，使用预冷的生理盐水漂洗后，加入 9倍体积的预冷生理盐水，冰水浴中匀浆，4℃、2500 r/min离心10 min，收集上清液，按照试剂盒说明书分别检测SOD、GSH-Px活力及MDA含量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况

NC组大鼠无明显异常表现，皮毛顺滑，行动自如，眼、口、鼻无异常分泌物，尿便正常；阿霉素给药后，大鼠出现精神萎靡，尿量不同程度下降，四肢水肿，体重减轻，毛欠光泽，秃顶，活动力差，进而出现红色尿液、消瘦等症状；阿霉素给药初期出现轻度腹泻，1周后转好；ART 组大鼠虽然也表现出体重下降，但毛色有光泽，活动力尚可整理表现要优于模型组，而ART-L组和ART-H组的大鼠体重相比无明显差别，大鼠体重变化见图 1。实验全程期间各组大鼠均无死亡情况。

2.2 ART对大鼠 24 h 尿液中UTP含量的影响

ADR模型组大鼠各时间点24 h 尿总蛋白(UTP)含量均高于NC组。经ART干预后，大鼠尿液中UTP含量有一定水平改善。结果可见，ART-L组及ART-H组较ADR组UTP含量明显降低，ART-H组较ART-L组进一步降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

图1 各组大鼠体重变化Figure 1 Rat body weight changes in each group

表 1 各组大鼠不同时间点 24 h UTP比较

2.3 ART对大鼠肾功能指标的影响

表2分析结果可见，与NC组比较，ADR模型组大鼠血清尿素氮(BUN)和血肌酐(Scr)明显升高。ART-L组和ART-H组两指标较ADR组低，差异均有统计学意义(P<0.05)。与NC组比较，ADR组大鼠血清白蛋白(ALB)降低，ART-H组和ART-L组较ADR组升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。而各组大鼠血清胆固醇(CHOL)和甘油三酯(TG)无明显变化，差异无统计学意义(P>0.05)。以上结果表明ART能改善ADR组大鼠的肾功能指标。

2.4 各组大鼠肾组织病理学变化比较

HE染色结果显示(见图2)，NC组大鼠肾小管排列紧密，肾小管上皮细胞无明显病变；与NC组相比，ADR组大鼠肾小管上皮细胞空泡及颗粒变性，部分细胞崩解、细胞碎屑阻塞管腔、裸基底膜形成； ART干预后，各病理症状明显好转，低剂量组大鼠可见部分肾小管上皮细胞空泡及颗粒变性，看见少量细胞碎屑阻塞管腔、裸基底膜形成，可见再生；高剂量组可见部分肾小管上皮细胞空泡及颗粒变性，刷毛缘脱落，可见明显再生。以上病理结果表明ART能改善肾组织损伤程度，明确了ART对阿霉素致大鼠肾损伤的治疗效果。

表2 各组大鼠生化指标检测结果比较

2.4 ART对大鼠肾组织 SOD、GSH-Px活力、MDA水平的影响

由表3可见，与NC组比较，ADR组大鼠肾组织 SOD、GSH-Px活力降低，而MDA含量升高(均P<0.05);与ADR组比较，ART-L组和ART-H组大鼠肾组织SOD、GSH-Px活力升高，MDA含量降低(均P<0.05)。

3 讨论

ADR是一种常用的抗癌药物。然而，其在正常组织，包括心脏和肾中的副作用限制了其临床应用[10]。ADR引起的急性肾损伤模型是一个成熟的和高重复性的肾病模型。AKI以管状细胞坏死为主要病理特征，所涉及的发病机制包括炎症、氧化应激和凋亡等[11-12]，其中，氧化应激是由促氧化水平和对抗抗氧化防御机制之间的失衡导致的。研究表明ADR诱导的AKI与抗氧化状态加剧有关，包括脂质过氧化最终产物丙二醛(MDA) 含量升高和肾组织中抗氧化酶水平降低，从而导致了肾代谢途径的改变和肾血流动力学中断[13]。ART是经FDA批准的应用于抗疟疾治疗的一线药物，以往的研究表明，ART还具有很好的抗炎、抗肿瘤以及抗病毒等疗效[14]，此外，ART能够抑制抗氧化防御系统中非酶性和酶性成分活性，即GSH和SOD的水平降低，从而降低了细胞的氧化应激损伤[15-16]。对于ART能否通过降低了细胞的氧化应激损伤来改善ADR所致的肾损伤，需要进一步研究探讨。

注: A：NC组；B：ADR组；C：ART-L组；D：ART-H组。图2 大鼠肾的病理学改变Note. A, NC group. B, ADR group. C, ART-L group. D, ART-H group.Figure 2 Pathological changes of the kidney tissues in rats

表 3 各组大鼠肾组织 SOD、MDA和GSH-Px 水平比较

本研究利用ADR诱导的AKI大鼠模型探讨ART对AKI大鼠肾损伤的保护作用及机制研究。研究结果显示，与NC组相比，ADR组大鼠UTP及血清BUN、Scr水平升高，同时ADR组肾病粒结构严重损伤，肾小管上皮细胞空泡及颗粒变性，部分细胞崩解、细胞碎屑阻塞管腔、裸基底膜形成，符合急性肾损伤表现[11,17]。与ADR 组相比，ART-H组和ART-L组血清BUN、Scr水平明显下降，受损的肾生理结构部分得到恢复，这表明ART能够改善肾功能和肾组织的损伤。肾组织中 SOD、GSH-Px 活力和MDA水平可反映ADR处理后诱导的肾氧化和抗氧化状态。本研究结果显示模型组小鼠肾组织 GSH-Px 和 SOD 活力下降，MDA 水平升高，说明ADR可以造成肾组织的氧化和抗氧化状态的改变，抗氧化酶水平下降，而脂质过氧化物水平升高。与ADR组相比，ART-H组和ART-L组的SOD和GSH-Px 活力都明显升高，而MDA 水平明显下降。结果提示，ART可以促进细胞内抗氧化物质含量增加，提高细胞抗氧化应激能力，从而保护细胞免受氧化应激的损伤，这与文献中报道的一致[18]。

综上所述，AKI能明显改善ADR诱导的大鼠肾损伤, 其作用机制可能与AKI对细胞氧化应激的调节有关，而在此过程中涉及一些信号通路的激活，在以往的文献中均有报道[19-21]，但还需要本研究进一步验证。本实验证实了AKI对ADR诱导的大鼠肾损伤的保护作用，从而为ADR肾损伤的临床预防及治疗提供了理论依据。