银杏叶黄酮的研究进展及在饲料中的应用

宋立立，李 倩

（沧州师范学院，河北沧州 061000）

银杏（Ginkgo biloba）为中生代银杏科仅存的珍贵树种，素称 “植物界的明珠”（张鹏飞等，2017）。中医典籍记载，银杏叶可用于作为理血化瘀的药剂，具有活血化瘀通络之功效。银杏叶中含黄酮、银杏萜内酯等其他化合物共160多种。其中黄酮类化合物药用价值广泛，有改善血管循环，拮抗体内血小板活化因子，保护神经系统，抗肿瘤和抗癌等多种药理学功能（魏雨和张景迅，2018）。同时，将银杏叶黄酮添加到动物饲料中具有天然无毒、功能多样及经济绿色等多种优点。本文就目前银杏叶黄酮的生物学功能、提取纯化工艺、抗氧化性和抑菌性质的研究进展进行简要综述，并对银杏叶黄酮在饲料领域的应用前景进行展望。

1 银杏黄酮类化合物简介

黄酮类化合物作为一种天然植物成分广泛分布于银杏叶中，其结构中含酚羟基团，使pH呈弱酸性（肖咏梅等，2019）。按分子结构可将40种银杏黄酮类化合物分为三类：（1）黄酮醇及其苷类，共28种，其中单黄酮类苷元有7种。可以作为标准物来测算总黄酮苷含量。（2）双黄酮类（二聚体黄酮），分为6种。通常作为裸子植物的特征化学成分。（3）儿茶素类黄酮，分为6种（孙笑槐，2011）。

2 银杏叶黄酮生物学功能

2.1 改善血管循环 黄酮类的槲皮素可以增加血管内皮细胞中Ca2+浓度，从而启动血管舒张因子如NO的释放，并扩散进入平滑肌使血管扩张（朱益等，2004）。 李天一等（2009）通过研究发现，银杏叶提取物中的黄酮成分可显著降低患肝肺综合征大鼠肝、肺组织中的血管扩张因子和内皮素等，对该症起治疗作用。银杏叶黄酮还可降低血管紧张素转换酶因子的含量，诱导鸟苷酸环化酶激活血管平滑肌中的cGMP，从而抑制肌球-肌动蛋白复合体信号通路，使血管扩张 （王绣锦和李芝静，2009）。此外，银杏叶中黄酮类化合物对血小板凝集和血栓形成有抑制作用，有利于防止和治疗动脉粥样硬化（陈健康和王雷，2001）。

2.2 保护神经系统 银杏叶中的黄酮成分有抗血管栓和增强代谢的作用，能增加脑血流量，预防和治疗多种脑缺血性疾病（孙芳等，2014）。同时其抗氧化作用可以提高机体免疫力，改善心脑血管型痴呆、老年痴呆症患者和糖尿病患者的血管和脑干细胞功能。罗旭敏等（2005）发现，银杏叶黄酮中的黄芩甙成分能明显抑制大鼠脑分区切片上由K+引起的谷氨酸（Glu）释放，从而有效避免由Glu过度释放而造成的多种神经性脑损伤。此外，银杏叶中的黄酮类化合物还能通过抑制去甲肾上腺素、KCl等物质引起的细胞中Ca2+通道的开放，避免Ca2+过度释放造成的兴奋性神经性损伤，对脑细胞具有保护的作用（吕跃玮和郭建友，2016）。

2.3 抗肿瘤、抗癌作用 银杏叶黄酮具有预防恶性肿瘤和癌症的作用，特别是针对原发性的卵巢癌、乳腺癌和前列腺癌等对雌激素依赖性肿瘤（张立虎等，2019）。其抗肿瘤作用的分子机制包括增强细胞抗氧性、抑制肿瘤细胞的增殖、激活促肿瘤坏死因子、延缓细胞周期、促使分化凋亡、抑制信号转导及细胞间的相互接触等。杜辉等（2013）研究得出，银杏叶黄酮可使人卵巢恶性畸胎瘤PA1阻滞在G1期，但对卵巢的功能细胞没有损伤。老年肿瘤患者的血液高凝状态会促进肿瘤增殖及在体内的扩散。苏雷等（2014）研究发现，银杏叶黄酮能通过减少血浆纤维蛋白原和D-二聚体的水平来抑制血液高凝状态，对老年肿瘤有一定的治疗作用。Qian等（2015）研究得出，银杏黄酮能阻止核内调控蛋白的表达从而阻遏胃癌因子生长的信号通路。

2.4 抗纤维化作用 银杏叶黄酮对纤维的形成有抑制作用，可保护内部组织器官。异鼠李素是银杏叶中含有的一种黄酮醇类物质，白跳等（2018）研究发现，异鼠李素对肝纤维化糖尿病大鼠的纤维化过程有一定的干预抑制作用，并且可有效地通过抑制大鼠心肌TGF-β/Smad通路来治疗心肌纤维性硬化等纤维化疾病。何明等（2005）进行临床观察和试验得出，以银杏黄酮甙的联合用药可以治疗肺间质纤维化，其治病机理有可能与影响体内免疫细胞因子有关。曹雯等（2015）研究了以3种黄酮甙联合用药对肝纤维化大鼠的临床治疗效果及作用机制，结论分析得出，银杏黄酮类活性物质能有效地对抗CCl4诱导的肝脏组织纤维化，并对大鼠肝脏功能起到一定的保护作用。

3 银杏叶黄酮的提取和纯化工艺

3.1 银杏叶黄酮的提取工艺

3.1.1 有机溶剂提取法 有机溶剂提取法是最为传统也是目前使用最普遍的一种方法，一般使用乙醇、甲醇等有机溶剂进行提取，在国内主要采用乙醇回流提取。宋静静等（2015）优化了银杏叶黄酮的提取工艺，得出在乙醇浓度50%，固液比1:45，提取时间2 h，温度70℃的提取条件下，银杏叶黄酮提取率可以达到最高。邵京等（2013）通过正交试验得出了有机溶剂提取银杏叶黄酮的最佳工艺方式，当料液比1:20，提取温度90℃，乙醇浓度50%，提取时间6 h时，黄酮含量最高约占提取物的35%。

3.1.2 微波辅助提取法 近几年微波辅助提取法萃取黄酮类物质也渐渐兴起。其主要原理是在微波高温环境下使细胞破裂，细胞内有效成分自由流出后利用各物质介电常数的不同，使不同组分以不同速度再分离 （罗泰然，2018）。徐春明等（2014）得出，微波辅助乙醇法提取银杏黄酮的优化条件：在固液比 1:25（mL:g），微波功率 300 W的条件下，用体积分数为70%乙醇微波提取60 s，总黄酮的提取得率可达到2.690%。梁晓峰（2012）研究显示，与乙醇溶剂萃取相比，微波辅助提取可将银杏黄酮的收率提高1.64倍。

3.1.3 超声波提取法 超声波提取是近年来发展的新型提取黄酮类物质的方法，原理是利用强烈空化效应，强烈地搅拌、振动等所产生的机械效应，加速含黄酮植物的细胞壁和细胞膜裂解，导致黄酮高速脱离植株并高效溶解于溶剂中。此法所用仪器简便，自动化程度高，可适用于工厂大规模生产。于德涵等（2020）采用响应面法优化超声波提取银杏叶总黄酮的提取工艺，得出在50℃提取温度下，用63%的乙醇提取32 min后，银杏叶中黄酮提取率可高达5.328%。

3.1.4 酶解辅助提取法 银杏叶细胞壁主要由纤维素等聚合的高分子化合物构成，银杏叶黄酮不易流出。酶解辅助提取法的原理主要是利用纤维素酶能降解植物细胞壁骨架结构，使细胞破裂后黄酮类物质释放到溶剂中再进行提取。酶解法具有针对性强、安全性好、提取条件温和、工艺简单可行等优点。石会军等（2014）进一步优化了纤维素酶法提取银杏叶总黄酮的工艺条件，得出浸提液pH 5.2和酶解温度为80℃的条件下，用0.90%纤维素酶酶解60 min，提取率最高为3.452%。张伟等（2014）研究传统提取和纤维素酶辅助剂提取银杏叶黄酮的效果发现，添加纤维素酶后银杏叶黄酮得率提高了45.8%。

3.1.5 超临界流体萃取法 该萃取的方法主要是通过利用在特定环境下超临界流体的黏度较低、扩散系数大、溶解性和传质性能良好的特点，通过调节流体压力和温度的方式来选择性地从固体或液体中萃取某一组分，之后再通过使这些超临界的流体变成惰性的气体从而与超临界的产物进行分离 （杨小青等，2014）。超临界流体可以循环使用，具有能耗低、天然活性成分不易破坏、安全性高等优点，但成本投入比较大，目前超临界二氧化碳作为萃取流体应用最多。赵琦君等（2009）研究显示，当加入90%乙醇作夹带剂，在温度50℃，压力35 MPa的条件下超临界萃取1.5 h，总黄酮提取率达到最大。

3.2 银杏叶黄酮的纯化方法

3.2.1 膜分离法 膜分离法是以半透膜作为介质，通过控制半透膜上的孔径大小，从分子水平对混合液中的物质进行选择性分离。半透膜按孔径大小可以分为RO、NF、UF、MF等。膜分离法具有工艺简单方便、低能环保、成本低廉等优点。向文艺等（2012）在研究膜分离法提取银杏叶黄酮时，使用透过性分子质量为10000的半透膜，在压力为0.30 MPa，纯化温度为30℃的工艺下纯化时，黄酮透过率高达72%。徐秋燕等（2015）利用超滤法提取银杏叶黄酮发现，在乙醇浓度为25%，超滤温度为30℃，超滤压力为0.9 MPa时，提取物中的黄酮含量可达4.83%。

3.2.2 大孔吸附树脂法 大孔吸附树脂纯化主要原理是通过树脂的吸附能力对有效成分进行物理吸附。不同吸附树脂的型号、孔道大小和比表面积可对溶液中的有机物进行筛选。树脂纯化方法具有稳定性良好、使用周期长、吸附量大和可循环使用等特点。杨文婷等（2014）用D101树脂纯化银杏叶的总黄酮，当上样液浓度为2.0 mg/mL，洗脱剂为80%的乙醇，洗脱上柱流速为2 BV/h时，总黄酮的含量最高可达44.2%。李凤艳等（2018）研究了LX-68型树脂纯化银杏叶黄酮的工艺，得出当提取溶剂pH为4，流柱速度为2 BV/h，最后用70%乙醇洗脱时，提取物中总黄酮含量达27.30%。

3.2.3 聚酰胺柱层析法 聚酰胺柱层析法的基本原理是利用聚酰胺的酰胺基与黄酮类化合物的酚羟基之间作用形成氢键来对黄酮进行吸附和分离。尹秀莲等（2007）用聚酰胺树脂纯化法，研究了不同浓度乙醇洗脱对纯度的影响，得出每克聚酰胺粉平均吸附量为115 mg/g，用70%乙醇洗脱后，总黄酮的纯度为15.6%。

4 银杏叶黄酮抗氧化性及抑菌性研究

4.1 银杏叶黄酮的抗氧化性 银杏叶黄酮化合物是天然植物中的抗氧化剂，可以有效清除机体内各种自由基，如超氧阴离子自由基、羟基自由基、DPPH自由基，能够提高体内超氧化物歧化酶的活性，并有效地消除人体内氧化生成的各种不饱和脂类自由基、蛋白质自由基，避免人体细胞和组织受到氧化损伤。其作用机理在于：（1）黄酮类物质供氢能力强，可结合自由基离子，从而切断自由基连锁反应链而将其直接清除；（2）黄酮物质与金属离子鳌合使自由基无法生成；（3）保护和还原体内的维生素C等还原剂，还能起到协同抗氧化的作用（吕娜，2014）。 张光辉等（2018）将1 mL的银杏黄酮中加2 mL DPPH自由基溶液，抗自由基活性最高可达68.90%。李敏等（2013）发现，银杏叶黄酮对三种自由基的清除力度随着黄酮添加量的增大而加强，且清除能力高于同浓度的维生素C溶液。

4.2 银杏叶黄酮的抑菌性 黄酮类化合物能使细菌蛋白质凝固或变性，主要原理是黄酮类化合物结构中含酚羟基团，使pH呈弱酸性，并且其作为酚类物质的衍生物还可破坏细菌细胞壁和细胞膜骨架，细胞内成分被释放出来，从而使微生物的生长受限（陈丛瑾等，2011）。随着当今社会抗生素的大量滥用，细菌的耐药性也越来越强，银杏叶黄酮具备作为一种纯天然的食品防腐剂的潜力，当其与其他天然防腐剂或人工防腐剂混合使用时，抗菌防腐效果更佳。胡筱等（2014）通过抑菌圈试验研究得出，银杏黄酮对大多数菌类都有抑制功效，但对食品中菌类的抑制效果由食品的性质与状态决定。豁银强等（2012）采用滤纸片法进行抑菌试验，得出银杏叶黄酮溶液对微生物的抑菌效果细菌>霉菌>酵母菌。黄其春等（2012）发现，银杏叶黄酮对动物肠道中的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气肠杆菌和铜绿假单胞菌等有害菌群，都表现出很好的抑制效果。

5 银杏叶黄酮在饲料中的应用

随着禽畜养殖业的不断发展，人们对禽畜产品的要求也越来越高，既要达到营养需求，又要保证产品安全卫生、无副作用。银杏树资源在我国储量丰富，并且银杏叶黄酮化合物无耐药性、无免疫抑制，具有营养、药理双重效果，可作为添加剂添加到动物饲料中。

银杏叶提取物中的有效成分黄酮能抑制病原微生物的生长，维持动物肠道环境稳态，提高生殖能力和抗病能力，还能预防肿瘤等疾病发生，对家畜、家禽的健康有促进作用。陈强等（2013）在鸡饲料中添加银杏叶提取物发现，平均日增质量显著高于其他肉鸡，并且肉鸡的抗氧化性能显著提高，其血清中丙二醛含量显著降低，而血清球蛋白的含量和超氧化物歧化酶的活力显著提高。任小杰等（2018）通过研究日粮中添加不同剂量银杏叶提取物对肉雏鸡生产性能及血清蛋白水平的影响发现，肉鸡血清中高密度脂蛋白的含量显著升高，低密度脂蛋白、甘油三酯、胆固醇等物质含量下降，从而改善肉质的食用品质。另外，黄酮可以作用于动物生长轴上的有关受体，刺激动物体内分泌内生长激素，促进机体加快生长（许啸和齐智利，2012）。曹福亮等（2006）将发酵后的银杏叶作为饲料添加剂喂食黄羽肉仔鸡，一段时间后检测肉鸡的生长情况发现，银杏叶发酵产物对黄羽肉仔鸡生长有显著的促进作用，平均日增重比对照组提高5.74%。

近年来饲料行业研究的热点逐渐转向微生物与银杏叶混合制备发酵饲料。一方面，银杏叶中的活性物质被微生物的生长和代谢利用，可促进微生物合成更多活性物质如维生素、氨基酸、蛋白酶等。另一方面，银杏叶在微生物体内酶的催化下进行深度加工，能将银杏酸等有毒物质分解与转化。因此制备银杏叶发酵饲料具有理论和现实意义。银杏叶黄酮作为饲料添加剂功能多样，有经济绿色、无毒副作用、来源天然等多种优点，既能增强机体免疫，抑菌抗病毒，又有加快动物生长速度，提高肉质品质等功效，顺应了环保的大趋势而极具市场竞争力，可以作为一种安全绿色的多功能添加剂广泛应用于多种饲料工业和动物生产中，有广阔的发展前景。