探究低温条件下磷酸二氢铵种肥对甜菜子叶期幼苗生长及生理的影响

郝王森，李任任，於丽华，王宇光，耿 贵*

(1.黑龙江大学现代农业与生态环境学院,哈尔滨150080；2.黑龙江大学生命科学学院,哈尔滨150080)

0 引言

甜菜(BetavulgarisL.)是藜科甜菜属的二年生草本植物，具有喜冷凉湿润，耐低温、耐盐碱等特点，是我国乃至世界上重要的糖料作物之一，供应世界上约1/3的糖[1]。内蒙古、新疆、黑龙江是我国甜菜的主要产区，近些年这些地区的极端低温天气对甜菜的产品质量造成较大的伤害[2]，研究发现，施加外源物质能够提高低温条件下植物的的抗寒性，如γ-氨基丁酸(GABA)[3]、24-表油菜素内酯(EBR)[4]、脱落酸(ABA)[5]、水杨酸[6]、氯化钙[7]、K+[8]等。

磷酸二氢铵，又叫作磷酸一铵，简称一铵，其作为一种复合肥料，含有作物生长所必须的氮、磷等营养元素[9]，研究发现，磷酸一铵中所含的磷元素具有较好的移动性，挥发性，在土壤中能够利于植物的吸收[10]。适量施用磷酸一铵不仅能够促进作物的生长，还能提高作物对外界环境的适应能力，增强植物的抗逆性。如杜旭[11]等研究了4种不同的磷肥处理对尾巨桉DH3229的生长及抗性指标影响，发现磷酸一铵处理不仅能够促进尾巨桉DH3229苗木生长、提高苗木质量，还能够增加SOD、POD、多酚氧化酶(PPO)等多种抗氧化酶含量。陈兵兵等[12]发现氮肥含量一定时，施加磷肥，能够提高低温处理条件下苗期玉米的干物重，并且能够减弱低温对细胞膜造成的伤害。

目前针对磷酸二氢铵的研究主要用作植物肥料、动物饲料添加剂、木材、织物的防火剂等[13～14].而将其作为种肥，用于缓解植物低温胁迫方面的报道还较少。因此，本文通过研究磷酸二氢铵种肥不同用量对甜菜子叶期幼苗的冻害缓解效果，尝试将复合肥料作为一种抗寒外源调节剂，用于提高作物抗寒性、减轻作物低温寒害。对进一步提高甜菜产量，增加经济效益具有重要的实际意义，同时提供了一种新的作物防寒思路。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试甜菜品种为 KWS1176。

1.2 试验设计

盆栽试验于2020年7月在黑龙江大学甜菜研究所光照培养箱内进行。光照常温处理使用HPG-280HX人工气候箱，低温处理使用LRH-250CL低温培养箱。

试验共设置4种处理，每组8次重复。分别为T0:不加一铵；T1:施加0.25 g一铵；T2:施加0.5 g一铵；T3:施加1 g一铵。播种：每盆统一先放200 g土壤，土壤上层分别加入相应重量的一铵，用200 g的土壤覆盖一铵，再均匀放入20粒带包衣的种子，最后用100 g土覆盖。放入光照培养箱内培养，光照14 h/d，黑暗10 h/d，温度为8～20℃，从零点20℃开始，以2℃/h为标准先降低至8℃后升高回20℃，培养期间定时浇水，保持土壤相对含水量在70%左右，定时倒盆，保证每盆所受光照一致。

播种7 d后开始记录各个处理的发芽率，待幼苗第一对真叶露尖时，保留每盆中长势一致的甜菜幼苗进行低温处理，低温处理分成锻炼期和冷冻期两个时期。锻炼期和冷冻期培养箱设置情况见表1。低温处理后在温度为8～20℃光照培养箱里 恢复3 d，统计甜菜幼苗低温冻害死亡率。

表1 低温培养箱温度设置情况

1.3 干鲜重的测定

从各处理每盆中完整取5株幼苗，清理干净表面土壤，测定其鲜重，计算获得单株鲜重。将已知鲜重的甜菜幼苗放入105℃烘箱中杀青30 min，再以80℃烘至恒重，用万分之一分析天平称量5株幼苗干重，计算获得单株干重。每个处理重复3次。

1.4 生理指标的测定

叶片的相对电导率(REC)参考Xia等[15]的方法进行测定。将处理后的甜菜幼苗用去离子水冲洗干净，剪成小份，混合均匀，称取2 g放入20 mL刻度试管中，加入20 mL去离子水，真空抽气30 min，摇匀后用 DDS-307电导率仪测定初始电导率R1。再将试管封口沸水浴1 h，冷却后摇匀，测定最终电导率R2。相对电导率=R1/R2×100%。参考李合生等[16]的方法进行以下生理指标的测定。MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定; 抗氧化酶活性测定：SOD活性采用抑制NBT光还原比色法测定; POD 活性采用愈创木酚法测定; APX活性采用紫外线吸收法测定。渗透调节物质测定：可溶性蛋白含量测定考马斯亮蓝G-250 染色法; 脯氨酸含量测定采用酸性茚三酮法。

1.5 数据统计分析

采用Office2019和SPSS 20. 0软件对数据进行处理和统计分析。用单因素试验统计分析方法，对不同处理的试验数据进行差异显著性检测(显著性水平为P≤0.05)。

2 实验结果

2.1 不同水平磷酸二氢铵对甜菜幼苗生长以及出苗率、低温死亡率的影响

图1表明，低温处理前(图A)，各处理间的子叶期甜菜幼苗长势基本没有差异；但低温处理后(图B)与低温处理恢复24 h后(图C)，与施加磷酸二氢铵的T1～T3组相比未施加的T0组死亡率最高，随着磷酸二氢铵用量的逐渐增加，幼苗死亡率逐渐降低，说明随着磷酸二氢铵用量提高，促进子叶期甜菜幼苗的抗寒能力。

图1 不同水平磷酸二氢铵对甜菜幼苗生长影响表型图(A)低温处理前 (B)低温处理后(C)低温处理恢复24 h后Fig.1 Phenotypic diagram of different proportions of ammonium dihydrogen phosphate on growth of beet seedlings (A) before low temperature treatment (B) after low temperature treatment (C) 24 h after low temperature treatment

表2 不同水平磷酸二氢铵对甜菜种子发芽率和死亡率的影响Tab.2 Effects of different proportions of ammonium dihydrogen phosphate on germination rate and frostbite rate of sugar beet seeds

由表2可知，不同水平磷酸二氢铵种肥用量对子叶期甜菜幼苗的出苗率影响不大，各个处理之间差异不显著(P>0.05，下同)，但是经受冻害之后，各处理之间的幼苗死亡率却有显著差异(P≤0.05，下同)，T0处理的幼苗死亡率达到81.67%，比T1～T3组分别高出18.37%、46.94%、71.43%，T3组幼苗死亡率最低，冻害缓解效果最好。

2.2 不同水平磷酸二氢铵对冻害处理后甜菜幼苗干鲜重的影响

低温处理后，施加磷酸二氢铵处理后每株甜菜幼苗干鲜重与不施相比有所增加，其中，T3组增加最为明显，鲜重比T0～T2组分别增加了52.38%、48.21%、40.48%；干重分别比T0～T2组分别增加了50.44%、50.86%、34.18%，但T0与T1之间差异不显著。

图2 (A-B)低温条件下，不同水平磷酸二氢铵对甜菜幼苗干鲜重的影响Fig.2 (A-B) Effects of different proportions of ammonium dihydrogen phosphate on dry and fresh weight of beet seedlings at low temperature

2.3 不同水平磷酸二氢铵对冻害处理后甜菜幼苗叶片质膜透性的影响

磷酸二氢铵对冻害处理后甜菜幼苗质膜透性有较大影响(如图3(A-B))。结果表明，MDA含量在T0中表现为最高，比T1～T3组分别高出19.61%、35.00%、55.14%；随着磷酸二氢铵施用水平的增加，各组的相对电导率逐渐降低，与MDA含量呈现出相同的趋势。

图3 (A-B)低温条件下，不同水平磷酸二氢铵对甜菜幼苗MDA含量和相对电导率的影响Fig.3 (A-B) Effects of different proportions of ammonium dihydrogen phosphate on MDA content and relative conductivity of beet seedlings at low temperature

2.4 不同比例磷酸二氢铵对冻害处理后甜菜幼苗叶片抗氧化酶的影响

磷酸二氢铵对冻害处理后甜菜幼苗叶片抗氧化酶有较大影响(如图4(A-C))。可以看出，T3处理条件下，SOD、POD和APX酶的活性最低，而T0处理的几种酶的活性均为最高，T0组SOD、POD和APX活性分别比T3组高出25.83%、37.04%和33.33%。各处理的几种抗氧化酶含量均具有显著性差异。

2.5 不同水平磷酸二氢铵对冻害处理后甜菜幼苗叶片渗透调节物质的影响

磷酸二氢铵对冻害处理后甜菜幼苗叶片渗透调节物质有较大影响(如图5(A-C))。结果表明，各个处理之间的的脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量均有显著性差异，随着磷酸二氢铵水平的增加，各处理的脯氨酸和可溶性糖含量逐渐降低，在T0组中脯氨酸和可溶性糖含量最高，脯氨酸含量比T1～T3组分别高出23.97%、33.31%、50.54%，可溶性糖含量分别比T1～T3组高出13.25%、20.02%、29.71%。但T0组可溶性蛋白含量最低，随着磷酸二氢铵水平的增加，各处理的可溶性蛋白含量也呈逐渐增加，与脯氨酸和可溶性糖呈现的趋势相反。

图4 (A-C)低温条件下，不同水平磷酸二氢铵对甜菜幼苗抗氧化酶的影响Fig.4 (A-C) Effects of different proportions of ammonium dihydrogen phosphateon antioxidant enzymes in beet seedlings at low temperature

图5 (A-C)低温条件下，不同水平磷酸二氢铵对甜菜幼苗渗透调节物质的影响Fig.5 (A-C) Effects of different proportions of ammonium dihydrogen phosphate on osmotic regulation substances in beet seedlings at low temperature

3 讨论

温度是影响植物生长发育的重要生态因子之一，低温时间过长或者温度过低都会引起植物的生理功能障碍，进而影响植物的生长发育[17]。低温冷害同时会造成苗弱，植株生长黄化、萎蔫、迟缓、产量降低、品质降低的现象[18]。低温胁迫是限制植物生长的重要环境因素[19]。在本试验中，施加不同量磷酸二氢铵种肥，甜菜子叶期幼苗的冻死率以及干鲜重均有所不同。可以看出，未施磷酸二氢铵种肥幼苗受冻害最为严重，死亡率达到82.00%，而随着磷酸二氢铵种肥用量的增加，子叶期甜菜幼苗的冻死率显著下降；幼苗干鲜重有不同程度的增加，说明施加磷酸二氢铵能够减缓低温对子叶期幼苗的生长抑制，不同程度的促进幼苗的生长，这与杜旭[11]等的研究结果一致。

细胞膜是能够支持多种生理生化反应的动态结构，研究表明质膜是植物冻害的主要部位，对细胞膜的损伤可以通过低温度环境下的相对电导率和MDA含量来进行评估[20]。在本试验中，随着磷酸二氢铵比例的增加，T1～T3各处理组的相对电导率水平和MDA含量都呈现逐渐降低的趋势，说明施加磷酸二氢铵能够保护细胞膜结构，减少细胞膜的脂质过氧化和胞内溶质的外渗，而且随着磷酸二氢铵用量的增加，其对细胞膜的保护作用也在逐渐增加。

抗氧化酶是抗氧化系统的重要组成部分，用于清除植物体内的活性氧，提高植物的抗逆性，维持植物正常的生长发育[21]。陈兵兵等指出,在低温条件下随着施用磷肥的增加，使得超氧化物歧化酶(SOD)的活性逐渐增强，可以减少细胞膜透性，增加干物重[12]。杜旭等指出，磷肥对桉树进行处理后，苗木叶片的可溶性糖、蛋白含量显著提高，丙二醛(MDA) 含量及多种抗氧化酶活性显著降低。磷肥处理均有利于促进桉树苗木的生长[11]。本研究发现，在冷冻条件下随着磷酸二氢铵的不断增多，SOD、POD和APX活性呈显著下降趋势，这与前人的研究结果一致。说明磷酸二氢铵的施用一定程度上能够提高了甜菜的抗寒能力。

渗透调节是指植物在适应环境变化过程中重要的调节机制，当植物受到低温胁迫时，会有大量的有机渗透调节剂积累，如可溶性糖、甜菜碱、脯氨酸、蔗糖、游离氨基酸、可溶性蛋白，主要作用是降低渗透势，增强细胞的吸水能力，从而适应低温胁迫的过程[22]。植物在低温胁迫条件下会通过增加渗透调节物质的含量来降低自身水势，提高叶片保水能力。本研究发现，在冷冻条件下随着磷酸二氢铵量的增加，脯氨酸，可溶性糖呈下降趋势。低温条件下，T0中可溶性蛋白含量较低，施加磷酸二氢铵可增加甜菜子叶期幼苗中的可溶性蛋白含量。

4 结论

低温条件下，施加磷酸二氢铵种肥能够提高子叶期甜菜幼苗的抗寒性，随着磷酸二氢铵用量的增加，幼苗抗冻害能力不断增强。磷酸二氢铵作为一种复合肥料，一定条件下，也可以作为抗寒剂作用于作物，减少低温对作物造成的损失。