星点设计-效应面法优选七珠胶囊预防CCl4致小鼠急性肝损伤最佳剂量配伍的研究*

陶 山，李 倩，范 妤，△，翟秉涛，史晓燕，段丽芳

（1．陕西中医药大学基础医学院，陕西 咸阳 712046；2．陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳 712046）

七珠胶囊由太白楤木、湖北海棠、叶下珠3味中药组成，针对“湿热毒邪内侵，肝失疏泄，气滞血瘀”的中医理论[1]，以解毒祛湿、疏肝化瘀为治法进行组方遣药，主要用于治疗急慢性肝炎、肝损伤、肝纤维化。太白楤木具有驱风湿、散瘀血、止痛的功效。近年研究发现，太白楤木具有抗氧化、抗炎等作用，临床多用于治疗各种肝炎、肝硬化以及淋巴结肿大等症[2-4]。湖北海棠具有养肝和胃、消积化滞等功效，以往研究表明，湖北海棠对急慢性肝损伤有显著的保护作用[5-8]。叶下珠具有平肝清热、利水解毒的功效，在治疗传染性肝炎、痢疾等病中有很好的疗效[9-10]。本实验以太白楤木、湖北海棠、叶下珠3味药的有效部位提取物—太白楤木总皂苷、湖北海棠总黄酮、叶下珠总多酚作为七珠胶囊原料进行配伍，通过腹腔注射CCl4橄榄油溶液复制急性肝损伤小鼠模型，应用星点设计-效应面法优选确定七珠胶囊在预防急性肝损伤中各组分配伍的最佳剂量，为其临床应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6周龄昆明种小鼠136只，雌雄各半，体质量（20±2）g，清洁级，由西安交通大学动物实验中心提供，动物生产许可证号：SCXK（陕）2012-003。适应性饲养于（25±2）℃恒温动物房中，正常明暗交替，自如饮食饮水。

1.2 药物与试剂 太白楤木药材购于陕西眉县药材公司，经陕西中医药大学王继涛高级实验师鉴定为五加科（Araliaceae）植物太白楤木（Aralia taibaiensis）的根皮；湖北海棠药材购自湖北神农架药材公司，经陕西中医药大学王继涛老师鉴定为苹果属（Malus Mil）湖北海棠（Malus hupehensis（Pamp.）Rehd）的干燥叶；叶下珠药材购自陕西昊源中药饮片有限公司，陕西中医药大学王继涛老师鉴定为大戟科植物叶下珠（Phyllanthus urinaria L.）的带根全草；CCl4（天津天士力化学试剂有限公司，批号：20140228）；橄榄油（广州花之王化工有限公司，批号：20140528）；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号分别为：20140909、20140923）；其它试剂均为分析纯。

1.3 仪器 Centrifuge 5417R台式冷冻高速离心机（Germany Eppendorf），HHS-4A 电热恒温水浴锅（沪越实验仪器厂），JA2003型电子分析天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司，精度：1 mg），BIORAD Model 680酶标仪（北京伯乐生命科学发展有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组 洁净级136只昆明种小鼠，随机分为17组，每组8只。以七珠胶囊各组分作为星点设计实验方案的考察因子，以太白楤木总皂苷、湖北海棠总黄酮、叶下珠总多酚作为因素，各因素分别在前期实验筛选结果确定的有效剂量范围内均匀选取3个水平[11-12]，分组情况见表2。

1.4.2 造模方法 昆明种小鼠雌雄分笼饲养，适应性饲养5 d后用于实验。各给药组均按表1所设计剂量进行灌胃给药7 d，1次/d。末次给药后2 h，将0.1%的CCl4橄榄油溶液按0.1 mL/10 g进行腹腔注射，建立小鼠急性肝损伤模型[13]。在给药及建立急性肝损伤模型过程中，各组小鼠饮食、活动佳，均未见不良反应，无死亡。

1.4.3 取材 末次给药后禁食不禁水，16 h后摘眼球取血，3 000×g离心10 min分离血清，放入-20℃冰箱保存备用。

1.4.4 血清生化指标ALT、AST的测定 微板法检测小鼠血清AST、ALT含量，严格按照试剂盒说明书步骤进行，酶标仪570 nm处测定OD值，实验重复3次。

2 结果

2.1 星点设计法优选最佳配伍比例 根据星点设计原理[14-15]，在单因素基础上，选取太白楤木总皂苷（X1）、湖北海棠总黄酮（X2）、叶下珠总多酚（X3）为考察因素，每个因素设3个水平，用代码值-1、0、1来表示 。因素水平见表1，实验安排和结果见表2。

表1 星点设计因素与水平

表2 星点试验设计与结果表

2.2 模型拟合 用ANOVA分析效应面的回归参数。利用Design-Expert 8.0.6软件对表2数据进行多元回归拟合，得到七珠胶囊不同配伍组血清中AST、ALT指标对太白楤木/A、湖北海棠/B、叶下珠/C二项多次回归模型方程：综合评分Y=0.33-0.059A-0.069B+0.074C+0.17AB-0.10AC+0.057BC-0.13A2+0.091B2-8.877E-003C2，式中评分代表肝损伤小鼠血清含AST、ALT酶的活力，A、B、C分别代表太白楤木总皂苷，湖北海棠总黄酮，叶下珠总多酚3种组分的含量。该方程的相关系数R2=0.835 0，整体模型达到显著水平（P=0.042 3），能够反映血清酶活力与3味提取物给药量的关系。由表3可知，本实验设定区域范围内，整体模型达到显著水平（P=0.042 3），表明太白楤木总皂苷、湖北海棠总黄酮对酶的活力有明显影响，二次项中A、B的偏回归系数达显著水平，其他各项的偏回归系数均未达到显著水平。但是，回归方程失拟检验显著（P=0.000 5），说明未知因素对实验结果有一定干扰，后续需要进一步研究；模型拟合检验极显著，说明该方程与实际情况拟合很好，较好地反映了血清酶活力与3味提取物给药量的关系，因此得到的回归方程能较好的预测七珠胶囊不同配伍对急性肝损伤小鼠血清ALT、AST随各参数的变化规律。

表3 以AST和ALT为指标的拟合回归方程的方差分析结果

2.3 配伍优化与预测 在因变量与另两因素拟合为三维曲面图中，因只能表达含2个因素变量的函数，故固定3个变量中的1个为中值，以拟合的目标函数为数学模型，绘制因变量曲面图（图1、2、3），最终确定七珠胶囊最佳剂量配比为：太白楤木总皂苷0.05 g/kg，湖北海棠总黄酮0.84 g/kg，叶下珠总多酚1.25 g/kg。

图1 太白楤木总皂苷与湖北海棠总黄酮对AST、ALT的影响

图2 太白楤木总皂苷与叶下珠总多酚对AST、ALT的影响

图3 湖北海棠总黄酮与叶下珠总多酚对AST、ALT的影响

3 讨论

肝毒剂CCl4所诱导的肝损伤是最经典的化学性动物肝损伤造模方法，因模型简单易于执行、造模时间短等特点被广泛用于研究化学性肝损伤、肝纤维化发生的细胞分子机制以及保肝药物的筛选[16-17]。ALT、AST均为肝细胞内酶，其中，ALT是最常用的判断肝细胞是否受损的敏感性指标，AST水平高低则代表着肝细胞损伤的程度。正常情况下，血清中ALT、AST的含量较少，当肝损伤发生时，大量的ALT、AST从肝细胞进入血液，使血液中含量显著升高[18]。目前，血清ALT、AST是检测肝损伤的特异性标志，也是判断肝细胞损伤程度最为敏感的指标[19]。

七珠胶囊原制剂为汤剂，是由太白楤木、湖北海棠、叶下珠3味药组成，可有效治疗急慢性肝炎、肝纤维化，但携带不便，课题组前期研究中将其改为胶囊剂[20]。太白楤木总皂苷为太白楤木的主要活性成分，来源于其根皮。研究发现太白楤木总皂苷对于脑、心脏、肝脏都有保护作用[2，4]。湖北海棠总黄酮是从湖北海棠叶中提取的黄酮类成分，对于急慢性肝损伤治疗作用显著。研究发现湖北海棠叶总黄酮可减轻CCl4及酒精所致的大鼠肝脏损伤程度，以及抑制血吸虫所致的肝纤维化[6-7]。叶下珠总多酚具有较高的抗氧化活性，可降低肝细胞氧化应激损伤，有效保护肝功能，在治疗免疫性肝损伤中作用显著[9]。本实验结果显示，各给药组小鼠在以不同剂量组合灌胃后，血清中ALT、AST与模型组比较均有不同程度降低，表明七珠胶囊各成分配伍给药均能有效抑制肝损伤，修复受损肝组织。

星点设计-效应面法以实验所考察的自变量对效应的作用为依据，选取最佳指数并对其进行优化[21]。即通过建立数学模型描绘三维效应面，读取效应面较优区域的较佳配伍条件范围，继而回推出自变量取值范围即最佳实验条件的优化方法[22]。本实验通过效应面法，以急性肝损伤小鼠血清中ALT、AST的活性水平作为指标，对七珠胶囊各组分配伍进行优化配比，得到最佳剂量配伍为：太白楤木总皂苷0.05 g/kg，湖北海棠总黄酮0.84 g/kg，叶下珠总多酚1.25 g/kg。

星点设计-效应面法精密度高、预测性好，能较为全面、精确地反映七珠胶囊在预防小鼠急性肝损伤中最佳的药物成分配比，可为七珠胶囊的后续实验以及临床应用提供有效的科学依据。