抗痫颗粒质量标准研究

卫向锋，张 艳，牛春玲，王卫峰，王海峰

（1.陕西省西安中医脑病医院，陕西 西安 710032； 2.陕西省中医药研究院中药研究所，陕西 西安 710031；3.武警陕西总队医院，陕西 西安 710054）

抗痫颗粒由石菖蒲、天麻、羌活、丹参等16味中药材组方，具有健脾豁痰、熄风止痉之功效，主要用于治疗癫痫、风痰痫（痰蒙心窍、气逆风动证），在陕西省西安中医脑病医院多年临床经验方的基础上开发而成。本研究中采用薄层色谱（TLC）法定性鉴别处方中的天麻、羌活、丹参、陈皮和枳实，采用超高效液相色谱（UPLC）法测定天麻中天麻素和对羟基苯甲醇的含量，为该产品的质量控制提供客观的定性定量评价方法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

WatersAcquityH-CLASS型超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；BS210S型电子分析天平（精度为0.1mg），BT25S型电子分析天平（精度为0.01mg），均购自北京赛多利斯天平有限公司；FOEA26810D型纯水机（德国Millipore公司）；KH-300DE型数控超声波清洗机（昆山禾创超声仪器有限公司，功率为150W，频率为40 kHz）；HH-4A型四孔水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；WS70-1型红外快速干燥箱（上海市吴淞五金厂）；101型电热鼓风干燥箱（北京市永光明医疗仪器厂）；HCTP11B10型托盘药物天平（北京市宣武区天平厂）；WFH-201B型三用紫外分析仪（上海精科实业有限公司，含WFH-201B型紫外透射反射仪）。

1.2 试药

天麻素对照品（批号为110807-201809，供含量测定用，含量为96.7%），对羟基苯甲醇对照品（批号为111970-201702，供含量测定用，含量为99.4%），丹酚酸B对照品（批号为111562-201716，供含量测定用，含量为94.1%），橙皮苷对照品（批号为110721-201818，供含量测定用，含量为95.3%），羌活对照药材（批号为120935-201408），丹参对照药材（批号为120923-201615），陈皮对照药材（批号为120969-201510），枳实对照药材（批号为120936-201606），均由中国食品药品检定研究院提供；液相用试剂（色谱纯，德国Merck公司）；色谱用水为超纯水；其他试剂均为分析纯（天津富宇化学试剂厂）；抗痫颗粒（医院制剂，批号分别为20181101，20181102，20181103）。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别[1-12]

天麻：取样品5 g，研成细粉，置锥形瓶中，加70%甲醇15mL，超声处理30min，滤过，滤液作为供试品溶液。同法制备缺天麻的阴性对照品溶液。取天麻素对照品适量，加甲醇，制得质量浓度为1mg/mL的对照品溶液。分别吸取上述3种溶液，点于同一硅胶G板上，点样量为5μL，以乙酸乙酯-甲醇-水（9∶1∶0.1，V/V/V）为展开剂展开，显色剂用10%磷钼酸乙醇溶液，105℃加热显色。结果供试品溶液色谱中检出天麻素，阴性对照无干扰，详见图1 A。

羌活：取样品5 g，研成细粉，置锥形瓶中，加甲醇15mL，超声处理20min，取上清液作为供试品溶液。再同法制备缺羌活的阴性对照品溶液。取羌活对照药材1g，按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液。分别吸取上述3种溶液，点于同一硅胶G板上，点样量为5μL，以三氯甲烷-甲醇-氨水（7∶2∶0.5，V/V/V）为展开剂展开，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中检出羌活，阴性对照无干扰，详见图1 B。

丹参：取样品5 g，研成细粉，置锥形瓶中，加75%甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干后加水20 mL溶解，调pH至1～2，再用乙酸乙酯提取2次，每次25mL，水浴蒸干，加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液。再同法制备缺羌活的阴性对照品溶液。取丹参对照药材1 g，按供试品溶液制备方法制备对照药材溶液。取丹酚酸B对照品适量，加乙醇制得质量浓度为1mg/mL的对照品溶液。分别吸取上述4种溶液，点于同一硅胶G板上，点样量为5μL，以甲苯-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（2∶3∶4∶0.5∶2，V/V/V/V/V）为展开剂展开，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液中检出丹参和丹酚酸B，阴性对照无干扰，详见图1 C。

陈皮和枳实：取本品5 g，研成细粉，置锥形瓶中，加甲醇30mL，超声处理20min，滤过，取滤液15mL，浓缩至1mL，作为供试品溶液。再按供试品溶液制备方法制备缺枳实和陈皮的阴性对照品溶液。取橙皮苷对照品适量，加甲醇制得质量浓度为1mg/mL的对照品溶液。再取陈皮和枳实对照药材各1 g，同法制成对照药材溶液。分别吸取上述4种溶液，点于同一硅胶G板上，点样量为5μL，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13，V/V/V）为展开剂展开约4 cm，取出晾干，再以甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水（20∶10∶1∶1，V/V/V/V）的上层溶液为展开剂展至10 cm，以三氯化铝试液为显色剂，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果供试品溶液色谱中检出橙皮苷，阴性对照无干扰，详见图1D。

图1 薄层色谱图Fig.1 TLC chromatogram s

2.2 含量测定[13-15]

2.2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：BEH C18柱（50mm×2.1mm，1.7μm）；流动相：乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97，V/V）；流速：0.3mL/min；检测波长：220 nm；柱温：室温；进样量：天麻素对照品溶液2μL，对羟基苯甲醇对照品溶液1μL，供试品溶液及空白对照溶液各2μL。理论板数按天麻素峰计大于5000，UPLC图谱中，天麻素色谱峰分离良好，阴性对照无干扰。详见图2。

2.2.2 溶液制备

取天麻素对照品适量，精密称定，溶于100mL乙腈-水（3∶97，V/V）混合溶液（质量浓度为0.042mg/mL），即得。取对羟基苯甲醇对照品适量，精密称定，溶于250mL乙腈-水（3∶97，V/V）混合溶液（质量浓度为0.0239mg/mL），即得对照品溶液。取抗痫颗粒5g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入稀乙醇25mL，超声提取30min，放冷，用溶剂补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10mL，浓缩至干，加乙腈-水（3∶97，V/V）混合溶液，转移至25mL容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。同法制备缺丹参的阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

线性关系考察：分别精密量取上述天麻素对照品溶液（0.4，0.8，1.0，2.0，4.0，8.0μL）及对羟基苯甲醇对照品溶液（0.4，0.8，1.0，2.0，4.0，8.0μL），按拟订色谱条件进样测定，以进样量（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y天=8010660.31X天-11907.30（r=1）及Y羟=8542598.13X羟-3976.08（r=1）。结果表明，天麻素和对羟基苯甲醇进样量分别在0.0168～0.3360μg和0.00478～0.09560μg范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：分别精密吸取天麻素对照品溶液（质量浓度为0.042mg/mL）及对羟基苯甲醇对照品溶液（质量浓度为0.0239mg/mL），按拟订色谱条件连续进样6次。结果天麻素和对羟基苯甲醇峰面积的RSD分别为0.14%和0.24%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取新制备的同一供试品溶液，在室温下测定10h内的稳定性（每隔2h测1次）。结果天麻素和对羟基苯甲醇峰面积的 RSD分别为0.83%和2.58%（n=6），表明供试品溶液在10h内基本稳定。

重复性试验：取同一批（批号为20181101）样品6份，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定天麻素和对羟基苯甲醇含量。结果天麻素平均含量为0.9546mg/g，RSD为1.75%（n=6），对羟基苯甲醇平均含量为0.1853mg/g，RSD为1.50%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的抗痫颗粒样品细粉6份，每份约0.5g，精密称定，分别加入一定量的天麻素和对羟基苯甲醇对照品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果见表1。

图2 超高效液相色谱图Fig.2 UPLC chromatograms

表1 加样回收试验结果（n=6）Tab.1 Resultsofrecoverytests（n=6）

2.2.4 样品含量测定

取3批样品各适量，依法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进样测定。结果见表2。

表2 3批样品中天麻素和对羟基苯甲醇的含量测定结果（mg/g）Tab.2 Results of content determ ination of gastrodin and p-hydroxybenzenylmethanol in 3 batches of sam ples（mg/g）

3 讨论

3.1 薄层鉴别指标选择及色谱条件优化

处方中天麻、羌活、丹参、陈皮和枳实5味药材为主药，且药效成分清楚，可建立稳定可行的薄层色谱鉴别法，因此建立了5味药材的质量标准。考虑到抗痫颗粒提取工艺为水煎煮，因此鉴别指标主要选择水溶性有效成分，其中天麻鉴别指标选择其主要水溶性有效成分天麻素［16-18］；羌活鉴别指标选择羌活对照药材［19］；丹参鉴别指标选择丹参对照药材和水溶性有效成分丹酚酸B［20］；橙皮苷为陈皮和枳实中共有水溶性有效成分［21-23］，故选择橙皮苷为两者的鉴别指标。根据研究结果，所建立的5味药材的薄层色谱鉴别法有较强专属性，阴性对照均无干扰，可有效控制抗痫颗粒的质量。

3.2 含量测定指标选择及色谱条件优化

天麻素是天麻中主要有效成分，具有抗癫痫作用［17-18］，主要作用机制为保护神经、胶质细胞和血管内皮损伤而发挥抗癫痫作用。通过对治疗癫痫的中医处方的考证发现，其核心药物均有天麻［18］。本研究中以天麻素和天麻素苷元（对羟基苯甲醇）为含量测定指标，采用UPLC法测定，用以表征制剂质量，检测波长采用《中国药典》中“天麻”项下所用波长，流动相采用乙腈-0.05%磷酸溶液，反复调整比例，以拖尾因子、分离度、理论板数、基线作为评判标准，最终确定色谱条件，即流动相为乙腈-0.05%磷酸溶液（3∶97，V/V），流速为0.3 mL/min。该方法精密度、重复性及回收率均良好，供试品溶液在10 h内稳定性良好，可用于抗痫颗粒的质量控制。