超声波技术辅助酶解法提取杜仲叶总黄酮工艺优化*

王柏强，项 静，张 杰，刘 福

（1.川北医学院附属医院药剂科，四川 南充637000；2.川北医学院药学院，四川 南充637000）

杜仲叶为杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oliv.的干燥叶，其味甘、微辛，性温，归肝、肾经，有补肝肾、强筋骨、降血压、安胎等功效［1］。其有效成分主要为绿原酸等苯丙素类，芦丁等黄酮类，京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷等环烯醚萜类，松脂醇二葡萄糖苷等木脂素类［2］。黄酮类化合物在抗氧化、抑制脂质过氧化反应、预防动脉粥样硬化及保护心脑血管、防癌、抗癌等方面效果良好［3］。黄酮类化合物是胞内物质，传统的水提法或醇提法不能有效破坏其细胞壁，存在很大的传质阻力，导致提取效果欠佳［4］。目前，超声波技术和酶解技术的发展为高效提取天然活性物质提供了新方法［5］。酶解法可破坏细胞壁，使更多重要化学成分（如黄酮）溶出；超声波的空化作用可加速植物细胞壁破裂及活性物质释放，提高有效物质提取率。本研究中结合酶解技术和超声波提取技术，通过单因素试验及正交试验优化提取工艺，提高了杜仲叶总黄酮的提取效果。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

760CRT型紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）；PHS-SB型pH计（成都瑞驰分析控制仪器有限公司）；SB-25-12DT型超声波提取器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；HH-2型恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限责任公司）；TP-114型电子分析天平（德国赛多利斯股份有限公司，精度为0.1 mg）。

1.2 试药

杜仲叶，采自四川省广元市，经川北医学院李生茂副教授鉴定为正品，晒干备用。纤维素酶（10 000 U/g），果胶酶（30 000 U/g），均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号为0080-200707，纯度为95%）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量测定

对照品溶液制备：取干燥至恒重的芦丁对照品25 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，加60%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得（质量浓度为0.5 mg/mL）。

检测波长确定［6］：取对照品溶液0.3 mL，置10 mL容量瓶中，精密量定，加入5%亚硝酸钠0.5 mL，静置6 min，加入10%硝酸铝0.5 mL，混匀，静置6 min，加入4%氢氧化钠4 mL，60%乙醇定容，静置15 min。同法制备空白溶液。用紫外-可见分光光度计于400～800 nm波长范围内进行光谱扫描，扫描结果显示，于510 nm波长处有最大吸收峰。因此，确定最大吸收波长为510 nm。

线性关系考察：精密吸取对照品溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL，分别置10 mL容量瓶中。用0 mL试管做空白对照，于510 nm波长处测定吸光度，以芦丁质量浓度（C）为纵坐标、吸光度（A）为横坐标进行线性回归，得回归方程C＝1.732A＋0.071，r2＝0.999 9（n＝7）。结果表明，对照品芦丁质量浓度在0.25～1.50 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

样品含量测定：精确吸取药材初提液1 mL，置10 mL容量瓶中，操作同线性关系考察项下，重复测定3次，计算平均吸光度值。根据公式［总黄酮提取率（%）＝初提液中总黄酮质量/杜仲叶干粉质量×100%］计算总黄酮提取率。

2.2 统计学处理

采用SPSS17.0统计学软件分析。组间比较行t检验，正交试验数据采用正交设计助手Ⅱ进行分析和处理。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.3 单因素试验

2.3.1 酶的种类及用量

分别称取杜仲叶粉末5g，各12份，置12个锥形瓶中，均分成两组（纤维素酶组和果胶酶组）。按料液比1∶20（g∶mL，下同）加入60%乙醇溶液，调节pH至5.0，分别加入纤维素酶0，10，20，30，40，50 mg，加入果胶酶0，10，20，30，40，50 mg。恒温（50℃）下酶解60 min，每15 min搅拌1次，超声处理（功率为600 W，频率为40kHz）20 min，抽滤，得滤液，测定总黄酮含量，并计算提取率，平行操作3次。结果纤维素酶组总黄酮提取率分别为1.66%，2.41%，3.09%，3.19%，3.14%，3.09%；果胶酶组总黄酮提取率分别为1.58%，2.16%，2.82%，2.95%，3.01%，2.92%。两组提取率差异显著（P＜0.05）。当添加纤维素酶量超过30 mg时，总黄酮提取率逐渐下降。

2.3.2 料液比

分别称取杜仲叶粉末5 g，各6份，置6个锥形瓶中，按料液比1∶5，1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50加入60%乙醇溶液，调pH至5.0，加入纤维素酶30 mg，搅拌，溶解后在恒温水浴锅（50℃）酶解60 min，每15 min搅拌1次，其余操作同2.3.1项下步骤。结果总黄酮提取率 分 别 为2.49%，2.93%，3.17%，3.48%，3.43%，3.22%。可见，随着料液比的增加，总黄酮提取率逐渐增大，当料液比达到1∶30后再继续增加料液比，提取效率增加不明显。可能是料液比过大降低了酶和底物的浓度，减少了酶分子与底物分子的碰撞概率，使底物未得到充分酶解，导致总黄酮溶出差异不明显［7］。

2.3.3 酶解pH

分别称取杜仲叶粉末5 g，各6份，置6个锥形瓶中，按料液比1∶30加入60%乙醇溶液，分别调pH至3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，加入纤维素酶30 mg，搅拌溶解后在恒温水浴锅（50℃）酶解60 min，每15 min搅拌1次，其余操作同2.3.1项下步骤。结果总黄酮提取率分别为2.14%，3.26%，3.49%，3.37%，3.05%，2.73%。可见，pH 4.5时总黄酮提取率最大。

2.3.4 酶解温度

分别称取杜仲叶粉末5 g，各6份，置6个锥形瓶中，按料液比1∶30加入60%乙醇溶液，调pH至4.5，加入纤维素酶30 mg，搅拌，溶解后分别于恒温水浴锅35，40，45，50，55，60℃下酶解60 min，每15 min搅拌1次，其余操作同2.3.1项下步骤。结果总黄酮提取率分别为3.05%，3.42%，3.53%，3.46%，3.41%，3.22%。可见，合适的酶解温度有利于总黄酮的溶出，温度过低不能保证酶的活性，过高酶又易失活，故酶解温度保持在40～50℃为宜。

2.3.5 酶解时间

分别称取杜仲叶粉末5 g，各6份，置6个锥形瓶中，按料液比1∶30加入60%乙醇，调pH至4.5，加入纤维素酶30 mg，搅拌，溶解后分别于恒温水浴锅45℃条件下酶解30，60，90，120，150，180 min，每15 min搅拌1次，其余操作同2.3.1项下步骤。结果总黄酮提取率分别为2.81%，3.45%，3.60%，3.52%，3.24%，3.18%。可见，随着酶解时间的增加，总黄酮提取率逐渐增大；酶解时间为90 min时，酶解反应基本完成，总黄酮提取率最大；在90 min后提取率降低。因此，选择酶解时间为90 min。

2.3.6 乙醇体积分数

分别称取杜仲叶粉末5 g，各6份，置6个锥形瓶中，按料液比1∶30分别加入30%，40%，50%，60%，70%，80%乙醇，调pH至4.5，加入纤维素酶30 mg，搅拌，溶解后于恒温水浴锅45℃条件下酶解90 min，每15 min搅拌1次，其余操作同2.3.1项下步骤。结果总黄酮提取率分别为2.43%，2.97%，3.36%，3.64%，3.56%，3.08%。可见，杜仲叶总黄酮提取率随着乙醇体积分数的增大而增加，在60%以后增速减慢，同时杂质溶出也明显增多。故选择不同乙醇体积分数（50%～70%）作进一步考察。

2.3.7 其他因素

分别考察超声提取温度、超声时间对杜仲叶总黄酮提取率的影响。结果适宜的超声提取温度为40～60℃，超声时间为15～25 min。

2.4 正交试验优化总黄酮提取工艺

综合单因素试验结果，选取对总黄酮提取影响较大的纤维素酶用量（A）、料液比（B）、酶解pH（C）、酶解温度（D）、乙醇体积分数（E）、超声温度（F）、超声时间（G）7个因素，每个因素3个水平（见表1）。以总黄酮提取率为考察指标，选用L18（37）正交试验表（见表2）进行正交试验。结果见表3。可见，各因素对杜仲叶总黄酮提取率的影响效果大小为料液比＞酶解温度＞纤维素酶用量＞超声时间＞乙醇体积分数＞酶解pH＞超声温度。其中，料液比、酶解温度、纤维素酶用量、超声时间影响显著（P＜0.05）。根据直观分析及方差分析结果确定最佳工艺组合为A2B2C3D2E2F2G3，即纤维素酶用量30 mg，料液比1∶30，酶解pH 5.0，酶解温度45℃，乙醇体积分数60%，超声温度50℃，超声时间25 min。

表1 因素水平表Tab.1 Levels of factors

表2 L18（37）正交试验设计与结果Tab.2 Results of the L18（37）orthogonal test

2.5 验证试验

分别称取杜仲叶粉末5 g，各5份，置5个锥形瓶中，按料液比1∶30加入60%乙醇，调pH至5.0，加入纤维素酶30 mg，搅拌，溶解后于恒温水浴锅45℃条件下酶解90min，每15min搅拌1次，超声处理（温度50℃，功率600W，频率40 kHz）25 min，抽滤，得滤液，测定总黄酮含量。结果杜仲叶总黄酮平均提取率为3.80%，RSD为1.49%。

表3 方差分析结果Tab.3 Results of variance analysis

3 讨论

天然产物的提取过程中，加入一定量的酶可破坏构成药材细胞壁和细胞间质的果胶、纤维素、半纤维素等大分子化合物，使细胞内物质充分溶解，提高有效成分的溶出速率；降低提取温度，可缩短提取时间；减少溶剂用量，可提高有效成分提取率［8-9］。本试验中利用超声波辅助酶解法提取杜仲叶中的总黄酮，在单因素试验基础上通过正交试验优化杜仲叶总黄酮的提取工艺，得最佳工艺条件：纤维素酶用量30 mg，料液比1∶30，酶解pH 5.0，酶解温度45℃，乙醇体积分数60%，超声温度50℃，超声时间25 min。此工艺条件下杜仲叶总黄酮提取率为3.80%，与传统回流提取法比较，条件温和，溶剂用量较少，有效成分提取率高，节能、降耗，保护环境。