柚皮素对心肌缺血/再灌注损伤大鼠PI3K/AKT信号通路和内质网应激及其相关凋亡通路的影响*

兰 卓， 王 欢， 何夕松， 游丽萍， 徐 楠， 冯 健， 李家富

（西南医科大学附属医院心血管内科，四川泸州646000）

心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤是指短期内恢复缺血心肌的血流反而使缺血心肌的损伤加重的病理现象［1］，常见于心肌梗死的再灌注治疗（溶栓和PCI）和心脏体外循环手术中，很大程度上降低了心血管疾病治疗的效果。因而，改善心肌I/R 损伤的药物研究一直都是心血管领域的热门和难题。

凋亡被认为是心肌I/R 损伤重要的潜在机制之一，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是一种细胞凋亡调控途径，PI3K/AKT 信号通路则是一条经典的抗凋亡通路［2］。已有研究表明，PI3K/AKT 信号通路的激活可以通过调控ERS 及其相关凋亡通路从而减轻心肌I/R损伤［3-5］。

柚皮素（naringenin，NAR）是一种富含多种生物活性的黄酮类化合物，且广泛存在于柑橘类水果中，被大量用于预防动脉粥样硬化、高血压、心律失常等多种心血管疾病的研究中［6-7］。研究显示，在心肌I/R损伤的不同模型中，NAR 均具有保护作用［8-10］。本实验拟在明确NAR 减轻大鼠心肌I/R 损伤的基础上，探讨NAR 对内质网应激及其相关凋亡通路和PI3K/AKT信号通路的影响，为其临床应用提供参考资料。

材 料 和 方 法

1 相关药物及试剂

柚皮素（N164488）和 LY2940029（L124970）购自Aladdin；心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）酶联免疫吸附检测试剂盒购自ELK Biotechnology；TUNEL试剂盒购自Roche；抗cleaved caspase-3、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、caspase-12、p-PI3K 和 GAPDH 抗体购自 Abcam；抗葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）和p-AKT 抗体购自 CST；TTC 染色液、HRP 标记山羊抗兔Ⅱ抗和BCA蛋白质浓度测定试剂盒购自ASPEN。

2 实验设计

2.1 动物饲养、分组及给药 SPF级健康雄性SD大鼠48 只［6～8 周龄，体重180～200 g；购自成都达硕实验动物公司，许可证号为SCXK（川）2015-030］适应性饲养1周后按随机数字表法分成假手术组（sham组）、模型组（I/R 组）、柚皮素处理组（NAR 组）和柚皮素处理+LY294002 组（NL 组），每组 12 只。NAR 组和NL组造模前1周开始腹腔注射NAR（100 mg/kg），每天1次；sham组和I/R组给予等体积生理盐水；NL组在造模前30 min另外腹腔注射LY294002（0.3 mg/kg）。

2.2 模型建立及处理 参照王春艳［11］实验方法，首先用戊巴比妥钠（45 mg/kg，腹腔注射）麻醉大鼠；然后行气管插管术，连接小动物呼吸机人工通气；接着行开胸手术，寻找冠状动脉左前降支并在其近段下方穿线结扎阻断血流（sham 组仅穿线不结扎），可见左心室前壁光泽度降低，颜色变苍白；造成心肌缺血30 min 后恢复血流再通120 min；再灌注结束后，每组随机取6只大鼠腹主动脉血用于检测cTnI，每组取一半（6 只）大鼠心脏组织制成切片用于TTC 染色、HE 染色和TUNEL 染色，另一半大鼠心脏组织迅速冻存用于RT-qPCR和Western blot检测。

3 检测指标和方法

3.1 cTnI 检测 按说明书的方法和步骤，用Rat TNNI3 ELISA Kit检测血清中cTnI的浓度。

3.2 心肌组织病理学 用4%甲醛固定心肌组织24 h，然后进行脱水、石蜡包埋，接着将样本切成5 μm 厚，采用HE 染色，最后在光镜下随机选取3 个视野观察并拍片记录。

3.3 心肌梗死面积 取出心脏样本，用PBS 溶液洗净后将心脏切片（约2 mm 厚），然后用2%的TTC 溶液染色20 min（白色为梗死心肌组织，红色为正常心肌组织），最后对切片拍照并用Image-Pro Plus 图像软件对梗死面积进行定量分析。

3.4 心肌细胞凋亡 采用TUNEL 荧光染色法。常规石蜡切片，经二甲苯和梯度乙醇一系列浸洗后用蛋白酶k 工作液处理标本；然后加入TUNEL 反应混合液孵育60 min，滴加DAPI 染液避光孵育5 min，PBS 漂洗后封片；每个标本在荧光显微镜下随机选3个不同的视野观察TUNEL 阳性细胞（绿色荧光），TUNEL阳性细胞与细胞总数的比值为凋亡指数。

3.5 RT-qPCR 首先从心肌组织中提取RNA，然后进行逆转录获取cDNA，接着进行PCR 扩增。用GAPDH 作为内参照，测定 GRP78、CHOP 和 caspase-12的mRNA 表达量。具体操作步骤严格按说明书进行，引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3.6 Western blot 首先使用RIPA 裂解液从心肌组织中提取总蛋白；然后用BCA 蛋白质浓度测定试盒定量测定蛋白浓度，用SDS-PAGE 分离蛋白并转移到 PVDF 膜；接着分别用 cleaved caspase-3、GRP78、CHOP、caspase-12、p-PI3K、p-AKT 和 GAPDH 的Ⅰ抗稀释液在4℃条件下过夜孵育，再用Ⅱ抗稀释液室温孵育2 h；最后用化学发光试剂盒显影，用AlphaEase-FC软件分析目标条带的灰度值。

4 统计学处理

选择SPSS 21.0软件进行统计分析。用均数±标准差（mean±SD）表示实验数据。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 NAR对I/R大鼠心脏损伤的影响

1.1 心肌梗死面积 与sham 组相比，I/R 组心肌梗死面积显著增加（P＜0.05）；NAR 组梗死面积较I/R组显著降低（P＜0.05），而NL 组梗死面积较NAR 组增加（P＜0.05），见图1及表2。

Figure 1.Image of TTC staining of rat myocardial tissues in each group.White represents infarct area and red represents normal area.图1 各组大鼠心肌组织TTC染色图

表2 各组大鼠血清cTnI、心肌梗死面积和心肌细胞凋亡率的比较Table 2.Comparisons of serum cTnI，myocardial infarction area and myocardial cell apoptosis rate in each group（Mean±SD. n=6）

1.2 cTnI I/R 组血清 cTnI 浓度显著高于 sham 组（P＜0.05）；与I/R 组相比，NAR 能显著降低cTnI 浓度（P＜0.05）；加入 LY294002 的 NL 组 cTnI 浓度则低于NAR组（P＜0.05），见表2。

1.3 心肌组织病理变化 光镜下可见sham 组心肌细胞排列规则、结构完整、边界清晰，心肌纤维排列紧密，无明显变形、水肿和炎症细胞浸润；I/R组心肌细胞形态结构紊乱、心肌纤维出现断裂、坏死，间质中可见大量炎症细胞浸润；NAR 组心肌纤维排列稍疏，间质中少量炎症细胞浸润；NL 组心肌损伤介于I/R组与NAR组之间，见图2。

2 NAR对心肌I/R损伤大鼠细胞凋亡的影响

TUNEL 染色结果显示，与 sham 组相比，I/R 组可见代表凋亡细胞的绿色荧光显著增多，心肌细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）；与I/R 组相比，NAR 组绿色荧光显著减少，心肌细胞凋亡率显著降低（P＜0.05）；与NAR 组相比，NL 组心肌细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），见图3及表2。

Western blot 结果显示，I/R 组 cleaved caspase-3蛋白水平较 sham 组显著升高（P＜0.05）；NAR 组cleaved caspase-3 蛋白水平较I/R 组降低（P＜0.05）；NL 组 cleaved caspase-3 蛋白水平较 NAR 组升高（P＜0.05），见图4。

Figure 2.Images of HE staining of rat myocardial tissues in each group（scale bar=50 μm）.A：sham group；B：I/R group；C：NAR group；D：NL group.图2 各组大鼠HE染色图

Figure 3.Images of TUNEL staining of rat myocardial tissues in each group (scale bar=50 μm).Green shows nuclei of TUNEL-positive cells and blue shows nuclei of total cells.图3 各组大鼠TUNEL染色图

3 NAR对心肌I/R损伤大鼠ERS的影响

RT-qPCR 及 Western blot 结 果 显 示 ，I/R 组GRP78、CHOP 和 caspase-12 的 mRNA 和蛋白表达较sham 组显著增加（P＜0.05）；NAR 组 GRP78、CHOP和 caspase-12 的 mRNA 和蛋白表达较I/R 组减少（P＜0.05）；NL 组 GRP78、CHOP 和 caspase-12 的 mRNA和蛋白表达较NAR组增加（P＜0.05），见图5。

4 NAR 对心肌 I/R 损伤大鼠 p-PI3K 和 p-AKT 蛋白水平的影响

Western blot 结果显示，与 I/R 组相比，NAR 组 p-PI3K 和p-AKT 蛋白水平上调（P＜0.05）；与NAR 组相比，NL 组p-PI3K 和p-AKT 蛋白水平下调（P＜0.05），见图6。

讨 论

在体结扎大鼠冠脉阻断血流是目前研究药物对心肌I/R 损伤保护作用常用的模型之一。cTnI 仅在心肌中表达，且不受年龄、性别、心肌损伤部位等的影响，是确定心肌损伤的金标准［12］。心肌梗死面积与心肌组织病理学不仅可以反映心肌I/R 损伤的程度，还可以评价药物治疗心肌I/R 损伤的疗效［13］。本实验结果显示，与sham 组相比，I/R 组大鼠血清cTnI和心肌梗死面积显著增加，同时HE 染色显示I/R 组心肌细胞形态结构紊乱，心肌纤维出现断裂、坏死，表明造模成功。既往研究表明，NAR（100 mg/kg）能显著减轻I/R 引起的心脏损伤［10］，本实验同样也证实NAR（100 mg/kg）能减少血清cTnI 和心肌梗死面积，减轻心肌组织病理损伤，表明NAR 对大鼠I/R 损伤心肌具有保护作用。

Figure 4.Effects of naringenin on the expression of cleaved caspase-3 and the antagonistic effect of LY294002.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group；△P＜0.05 vs I/R group；#P＜0.05 vs NAR group.图4 柚皮素对cleaved caspase-3蛋白表达的影响及LY294002的拮抗作用

Figure 6.Effects of naringenin on PI3K/AKT signaling pathway and the antagonistic effect of LY294002.Mean±SD.n=6.△P＜0.05 vs I/R group；#P＜0.05 vs NAR group.图6 柚皮素对PI3K/AKT信号通路的影响及LY294002的拮抗作用

缺血会引起心肌细胞凋亡，再灌注则会进一步加重心肌细胞凋亡的程度，抑制细胞凋亡有助于减轻I/R 对心脏的损伤［14］。细胞凋亡的特征之一是caspases的激活，其中caspase-3是凋亡相关信号通路的集合，活化的caspase-3 可通过切割PARP 和DNAPK 等影响DNA 复制、转录和损伤修复，最终导致细胞凋亡的发生［15］。本实验中，I/R显著增加心肌细胞凋亡率和cleaved caspase-3的表达，而NAR 能降低心肌细胞凋亡率和cleaved caspase-3 的表达，提示NAR是通过抑制细胞凋亡从而发挥心脏保护作用。

细胞凋亡由多种通路调控，其中ERS 是近年来报道的一种较新的细胞凋亡调控途径。缺血、缺氧、氧化应激和钙超载等都能导致ERS，如果ERS 持续存在且程度严重就会激活相关凋亡信号通路（CHOP、caspase-12 和JNK 通路）从而启动细胞凋亡。近来研究表明，ERS 及其介导的细胞凋亡是心肌I/R病理过程中的重要损伤因素之一，抑制ERS 有助于减轻心肌I/R损伤［13，16-17］。

GRP78 是ERS 的分子伴侣，其表达增加常常提示ERS 的发生。既往研究表明，caspase-12 是介导ERS 凋亡通路的特异性caspase 分子，ERS 发生时可激活caspase-12，活化的caspase-12 级联效应激活caspase-9 和caspase-3，最终导致细胞凋亡的发生［18］。CHOP对ERS最为敏感，可通过调节Bcl2、TRB3等诱导细胞凋亡。Tang 等［9］的研究表明，在 H9C2 心肌细胞中，NAR 能通过调控ERS 及其介导的凋亡减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤。Yu 等［8］的研究进一步表明，在动物实验模型中，NAR能抑制ERS改善大鼠心肌I/R 损伤。本实验使大鼠心肌缺血30 min 再灌 注 120 min 后心肌 GRP78、CHOP、caspase-12 和cleaved caspase-3 的表达显著增加，证实了心肌I/R损伤可引起ERS 反应并激活ERS 相关凋亡通路；予以 NAR 预处理后 GRP78、CHOP 和 caspase-12 的表达较I/R 组降低，提示NAR 能改善心肌I/R 损伤引起的ERS及其相关凋亡通路。

为进一步探讨NAR 抑制心肌I/R 损伤引起的ERS 及其相关凋亡通路的作用机制，本实验研究了PI3K/AKT 信号通路在其中的作用。PI3K/AKT 是一条具有多种生物学功能的信号通路，它的激活可以通过抑制ERS 及细胞凋亡、改善能量代谢、减轻炎症反应及氧化应激等途径保护心肌I/R 损伤［19］。在本实验中，NAR 可显著促进心肌I/R 损伤大鼠PI3K 和AKT 的活化 。 LY294002 是 PI3K/AKT 信 号 通路的特异性抑制剂。在心肌I/R 模型中，LY294002（0.3 mg/kg）能有效阻断 PI3K/AKT 的激活［3，5］。本实验中LY294002 也选择该剂量，结果显示与NAR 组相比，NL 组p-PI3K 和p-AKT 的表达降低。进一步分析显示，抑制PI3K/AKT 信号通路后，NAR 的心脏保护作用减弱，同时其抑制ERS 及心肌细胞凋亡的作用也减弱，提示PI3K/AKT 信号通路介导了NAR 对I/R 大鼠心脏的保护作用。

综上所述，本研究提示NAR 可能是通过激活PI3K/AKT 信号通路而调控ERS 及其相关凋亡通路，从而减轻大鼠心肌I/R损伤。