实验牛微生物学和寄生虫学等级及监测地方标准的研究和制定*

李昌文 朱远茂 夏长友 陈洪岩

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室，国家禽类实验动物资源库，黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室，哈尔滨 150069)

实验动物作为生命科学的重要组成部分，不仅是国家科技创新的重要基础条件之一，而且是科学研究不可或缺的手段，更是提升科技创新能力的支撑和保障[1]。标准化是实验动物的根本属性，质量标准是实验动物质量控制体系中的重要组成部分，是实验动物微生物和寄生虫控制水平的依据，也是对实验动物进行分级的根本依据[2]。黑龙江省不仅是养牛大省，也是使用牛进行科研、生产、检定、教学等各项科研教学活动较多的省份。因此，潜在的多种可能发生的人兽共患病给生物安全带来了极大的威胁。同时，由于潜在的多种牛微生物和寄生虫的存在，也会影响实验数据的准确性、可靠性和重复性。近年来，随着使用实验牛数量逐年增加，这些风险正被逐渐的增大。目前，国内还没有与实验牛相关的国家或行业标准，因此亟需编制黑龙江省实验牛微生物学和寄生虫学质量控制标准。

1 标准编制的背景

随着生命科学研究的不断深入，实验牛的应用领域越来越广泛,例如：(1)畜牧兽医研究领域。实验牛作为兽用生物制品的原材料，同时也是兽用生物制品研发及产品检验的必备工具；(2)医学研究领域，利用转基因牛乳腺生物反应器生产药用蛋白，利用转基因奶牛改变牛奶成分，医学研究中主要用乳牛来制备小牛血清，供免疫学研究用，还可选用健康的牛肌肉、肝脏和体液制备培养基；(3)比较医学上应用，成熟期牛的一些遗传学异常作为人类遗传学比较研究的模型，包括先天性原卟啉症、神经节苷脂沉积症、软骨发育不全性侏儒症、先天性毛发稀少症、遗传性白内障、先天性甲状腺肿瘤、先天性心脏病、遗传代谢功能不全等。犊牛在体形和心脏的大小方面与人近似，常用于心血管外科研究。牛既可用于结核病、副结核病、布氏杆菌病等传染病研究，还可用作代谢病方面如低血钙、表皮角化症和发育不全性贫血的研究；(4)科学研究与教学。

《黑龙江省人民政府关于加快现代畜牧业发展的意见》黑政发[2015]25号文件指出，我省是畜牧大省，地处世界公认的黑土带、黄金玉米种植带和黄金奶牛养殖带，地域广阔、土壤肥沃、气候冷凉及环境优良，发展畜牧产业具有得天独厚的资源条件和区位优势。大力发展乳品业、奶牛、肉牛、生猪养殖及加工业。

黑龙江不仅是我国养牛业的重要基地，也是开展牛病研究的重要地区，包括众多开展牛病研究的科研院所、大专院校及医药企业，如中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、哈尔滨维科生物技术开发公司、东北农业大学、黑龙江八一农垦大学等。在牛病教学、牛病研究及与牛相关的疫苗生产、教学及其它科学研究中必然使用大量的实验牛，研究和生产用血清需求量更大。当前，实验牛多是从市郊或周边地区购买，其携带人兽共患病的病原微生物和寄生虫情况不明，会带来许多潜在危险。

我国目前还没有牛作为实验动物的标准，进行科学研究与教学使用的牛，只是以外观健康为标准进行选择。这些实验牛可能携带有多种传染病和寄生虫的病原体，甚至有的牛处于亚健康状态，患有人畜共患病，用这种动物进行实验或科学研究，势必会影响实验结果，甚至还能导致生物安全及公共卫生安全问题。因此，开展实验牛的标准化及标准制定工作，对于提高科学研究与教学使用的实验牛质量、提高科研结果的准确性、确保人身安全以及应对公共卫生风险也非常重要。

2 实验牛等级的设定

参照国内、外实验动物等级分类原则，结合实验牛的生产水平和实验要求，本标准按照微生物学和寄生虫学等级将实验牛划分为普通级和SPF级，未设定清洁级，主要是根据国内大多数实验动物专家的意见，考虑与国际实验动物标准接轨。目前国际上按照实验动物微生物学和寄生虫学控制是实验动物分级的根本标准分为普通级、SPF级和无菌级，不包括清洁级。清洁级和SPF级实验牛的环境设施标准一致，生产和使用成本相当，在微生物和寄生虫检测项目上难以划定。综合上述因素，在本标准中，取消清洁级实验牛的设定。

3 检测项目选取

3.1 需检测项目的选择

主要综合考虑以下9方面：①普通级和SPF级牛的定义；②国家现行法律法规的要求；③生物安全；④黑龙江省内牛微生物和寄生虫病的流行病学情况[3-11]；⑤检测方法的标准以及检测实验室的硬件条件；⑥临近省份和国家的牛微生物寄生虫病的流行情况[12-13]；⑦适用性和前瞻性；⑧实验牛的生产管理方式的改变；⑨输入性微生物和寄生虫病的防控和管理[14]。

3.2 普通级和SPF级实验牛寄生虫检测项目的选择

参考上述9方面内容，对普通级牛的检测项目设置重点考虑人兽共患病以及2015版《中华人民共和国兽药典》中的条款要求。普通级牛应排除棘球蚴(Echinococcusspp.)、弓形虫(Toxoplasmagondii)、体外寄生虫(Ectoparasitesspp.)、隐孢子虫(Cryptosporidiumspp.)、贾第虫(Giardiaspp.)和梨形虫(Piroplasmaspp.)。在《一、二、三类动物疫病病种名录》和《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》中将棘球蚴病和弓形虫病为二类动物疫病，是重要人兽共患寄生虫病。根据现有流行病学调查研究资料得出，黑龙江省牛体表寄生虫感染率很高，对牛的生长和发育影响极大。隐孢子虫和贾第虫病为人兽共患寄生虫病，为GB 5749—2006《生活饮用水生活标准》中规定的唯一排除两种寄生虫病原。现在，牛的饲养方式已经发生较大变化，由原来的游牧式为主转变为舍饲为主，牛与牛及人与牛的接触时间加长，且水源地距离较近。综合考虑，将以上两种寄生虫列入到普通级牛的检测项目。牛梨形虫在2015版《中华人民共和国兽药典》中为必检项目，在《一、二、三类动物疫病病种名录》中也被列为二类动物疫病。

在确定SPF级牛的检测项目时，除普通级应排除的病原体外，主要是选择对动物生长发育影响较大(腹泻病、血液病及繁殖障碍病)以及对实验结果存在较大影响的病原体。根据已知的流行病学调查研究资料，黑龙江省牛共有体内、外寄生虫58种，其中蠕虫(Helminths)35种，占60.34%；球虫(Eimeriaspp.)感染率为17.33%，是重点排除的寄生虫。除以上两种寄生虫外，牛锥虫(Trypanosome)病在《一、二、三类动物疫病病种名录》中被列为二类动物疫病，牛滴虫病(Bouine trichomoniasis)《一、二、三类动物疫病病种名录》中被列为三类动物疫病，新孢子虫病是由犬新孢子虫(Neosporacaninum)寄生于多种动物而引起的，分布于世界各地，主要危害是引起孕畜流产或死胎以及新生儿的运动神经障碍。同时，对牛的危害尤为严重，是引起牛流产的主要原因。然而，综合考虑，目前牛的饲养方式发生了较大的变化，因此需排除牛滴虫和新孢子虫引起繁殖障碍的寄生虫病原体。

3.3 普通级和SPF级实验牛微生物检测项目的选择

目前我国牛病发生特点是发病率高、病原体耐药性增强、人畜共患传染病的几率上升、肢蹄病、繁殖障碍性和呼吸系统疫病发生率较高、牛疫病种类增多、混合感染问题严重、诊治难度增大等。根据上述牛病的发生特点和流行趋势，确定普通级实验牛病原微生物检测项目和检测方法，主要排除携带的人兽共患病病原微生物和烈性传染病病原微生物，具体检测项目有口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth disease virus,FMDV)、布鲁氏菌(Brucellaspp.)、牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)、炭疽芽胞杆菌(Bacillusanthracis)、钩端螺旋体(Leptospirosisspp.)、伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)及贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii)[15-21]。

自2008年以来，我国牛群爆发严重的呼吸道疾病，表现为牛呼吸道疾病综合征，抗生素治疗效果不明显、发病率高及死亡率高，给养牛业带来极大的经济损失。最近几年我国肉牛及奶牛的存栏量持续下降，牛呼吸道病的爆发是主要原因之一。病原流行病学调查显示存在多病原感染，其中主要原发病因为病毒性病原，包括牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus 3,BPIV-3)、牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea/Mucosal disease virus,BVDV)、牛呼吸道合胞体病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)等。病毒感染呼吸道上皮细胞造成局部损伤，使呼吸道黏膜的防御能力下降，同时引起机体免疫抑制，继发细菌/支原体感染，如多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)等，引起严重的肺炎，导致牛呼吸道疾病综合征。流行病学调查显示，我国牛副流感病毒3型血清阳性率达77.96%(2 960/3 797)，牛传染性鼻气管炎血清阳性率达46.03%(3 933/8 545)[22]。我国对牛副流感病毒3型和牛传染性鼻气管炎均未进行免疫接种，高血清阳性率说明我国牛群中感染非常普遍。运输、气候变化、混群等应激因素常常导致牛呼吸道病原的感染，而作为实验牛经历运输等应激因素是必然的。另外牛病毒性腹泻、牛副流感病毒3型、牛白血病病毒(Bovine leuknia virus,BLV)等可引起免疫抑制，感染后不宜作为实验牛，所以本标准排除牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛副流感病毒3型、牛荚膜A、B型多杀性巴氏杆菌、牛呼吸道合胞体病毒及牛白血病病毒。犊牛腹泻是养牛场饲养管理过程中面临的最主要的奶牛健康问题之一，危害主要表现为饲料利用率下降、治疗成本增加以及不同程度的死亡率，造成严重的经济损失。牛轮状病毒(Bovine rotavirus，BRV)是引起犊牛腹泻的最主要病原，发病率可高达50%～100%，7日龄以内犊牛最为易感，典型症状为严重腹泻、粪便呈水样、色呈淡黄色、有时混有黏液和血液、犊牛脱水、眼凹陷、四肢无力、消瘦及卧地，感染后不再适合作为实验牛，故本标准把牛轮状病毒列为排除的病原之一[23]。结合黑龙江省牛病流行特点确定实验牛SPF牛病原微生物检测项目和检测方法，除普通级应排除的病原体外，排除不携带所规定的潜在感染或条件致病和对科学实验干扰大的微生物，具体包括牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻/黏膜病病毒、牛副流感病毒3型、牛荚膜A、B型多杀性巴氏杆菌、牛呼吸道合胞体病毒、牛轮状病毒、副结核分枝杆菌(Mycobacteriumparatuberculosis)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacterfetus)、牛白血病病毒和衣原体(Chlamydiaspp.)。

4 检测方法

目前寄生虫检测方法较为成熟，实验室通用方法为虫卵、虫体及抗体水平的测定，即通过对实验牛的分泌物、排泄物、毛发、皮肤等样品收集处理，直接进行虫卵或虫体的形态学检查，确定是否体外寄生虫等存在。对采集的血液进行血清学诊断，通过抗体水平判定弓形虫(Toxoplasmagondii)等是否感染牛体。本标准所涉及病原的检测，均参照相关的国标或行标，具体检测方法，参照表1所列。

表1 实验牛寄生虫检测方法

在本次地标制定中，对实验牛进行微生物检测。首先选择有国标或行标的检测方法，未有以上标准的，使用经过中国农业科学院哈尔滨兽医研究所牛羊传染病研究创新团队建立验证的方法。牛副流感病毒3型Real-time PCR诊断方法、牛荚膜A、B型多杀性巴氏杆菌多重PCR诊断方法、牛呼吸道合胞体病毒套式Real-time PCR检测方法、牛轮状病毒多重半套式Real-time PCR检测方法为本单位牛羊传染病研究创新团队提供的切实可行的方法，这些方法均适用于我国上述牛流行病原的检测，具有敏感性高及特异性强的特点，并经当地检测和诊断应用表明上述诊断方法准确可靠。具体检测方法参照表2。

表2 实验牛病原微生物检测方法

5 预期社会效益

本标准的制定可为我省农业实验动物新资源提供标准及技术保障和为公共卫生乃至生物安全提供重要的基础条件支撑，实现实验动物资源建设领域、关键技术问题的突破并提升实验动物科技工作对科技发展与创新的支撑能力和水平。本标准的实施可为动物养殖业的健康可持续性发展起到推动作用，为重大动物疫病研究提供高质量实验动物并为生物制品的研发、生产及检定提供标准化实验动物。不仅增强生物制品的核心竞争力，推动我国传统生物制品产业技术升级，提升我国相关产业竞争力和国际影响力，进而带动我省乃至我国畜牧业行业技术进步及健康发展，确保阻断人畜共患病对人类健康的影响，促进经济、社会健康及持续发展具有重要意义。不仅如此，还为我国生命科学领域的研究及产业开发提供重要的支撑条件，对解决动物、动物产品及生物制品的技术瓶颈具有重要意义。

6 讨论

现行的《中华人民共和国标准化法》第二条中规定：标准包括国家标准、行业标准、地方标准、团体标准及企业标准。国家标准分为强制性标准及推荐性标准。行业及地方标准是推荐性标准，赋予了地方标准明确的法律地位。第十三条规定：为满足地方自然条件、风俗习惯等特殊技术要求，可以制定地方标准，地方标准应具有地方的特色。黑龙江省地方标准《实验动物牛微生物学等级及监测》和《实验动物牛寄生虫学等级及监测》的研究和制定就是充分考虑到黑龙江省特殊的地理位置和气候条件并结合实验牛的主要传染性疾病的发生发展规律而制定的，比如流行性出血热和血吸虫病是牛的烈性传染病，但是由于我省特殊的地理生态条件，这两种病原体均未列为检测项目。

充分的收集和整理流行病学资料，做好深入的调研和分析是制定实验牛微生物学和寄生虫学检测标准的重要前提。目前，我省正在大力推进“两牛一猪”项目，近几年来从国外引进的奶牛和肉牛的数量较大，这给输入性动物疫病的防控带来了极大的压力和隐患。同时，目前我国畜牧业的发展趋势是产能北移及产品南移，这将会造成人流和动物流的频繁交叉，给国内动物疫病的流动提供了便利。由于时间和能力所限，针对上述发生的现象，标准编制小组调查分析做的还不够充分，使得本标准的前瞻性显得不强。